LIETUVOS RESPUBLIKOS SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRO

Į S A K Y M A S

DĖL CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ ŪMAUS, KARTOTINIŲ DOZIŲ, POŪMIO, LĖTINIO IR SPECIFINIO TOKSIŠKUMO BEI ALTERNATYVIŲ TYRIMO METODŲ PATVIRTINIMO

2004 m. liepos 5 d. Nr. V-508

Vilnius

Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų įstatymo (Žin., 2000, Nr. 36-987) 6 straipsnio 2 dalimi, Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmogaus sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos, patvirtintos Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2000 m. gruodžio 29 d. įsakymu Nr. 762/556 „Dėl Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmonių sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos“ (Žin., 2001, Nr. 3-60), 11.1 punktu ir įgyvendindamas 1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvos 67/548/EEB dėl šalių narių įstatymų, reglamentų ir administracinių nuostatų, susijusių su pavojingų medžiagų klasifikavimu, pakavimu ir ženklinimu, suvienodinimo, Komisijos direktyvos 1988 m. lapkričio 18 d. devintąjį kartą su technikos pažanga derinančios Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo 88/302/EEB, Komisijos direktyvos 92/69/EEB 1992 m. liepos 31 d. septynioliktąjį kartą dėl technikos pažangos derinančios Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo, Tarybos direktyvos 96/54/EB 1996 m. liepos 30 d. dvidešimt antrą kartą derinančios su technikos pažanga Direktyvą 67/548/EEB dėl pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą reglamentuojančių įstatymų ir kitų teisės aktų suderinimo, 1999 m. gegužės 31 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyvos 1999/45/EB dėl šalių narių įstatymų, reglamentų ir administracinių nuostatų, susijusių su pavojingų preparatų klasifikavimu, pakavimu ir ženklinimu, suvienodinimo, Komisijos direktyvos 2000/33/EB 2000 m. balandžio 25 d. dvidešimt septintą kartą derinančios su technikos pažanga Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo, Komisijos direktyvos 2001 m. rugpjūčio 6 d. dvidešimt aštuntą kartą derinančios su technikos pažanga Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo 2001/59/EB reikalavimus:

1. Tvirtinu pridedamus cheminių medžiagų ir preparatų ūmaus, kartotinių dozių, poūmio, lėtinio ir specifinio toksiškumo bei alternatyvius tyrimo metodus:

1.1. Ūmus toksiškumas per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių metodas (B1³);

1.2. Kartotinių dozių 28 dienų toksiškumas per odą (B9);

1.3. Poūmis toksiškumas per virškinimo traktą. Kartotinių dozių 90 dienų toksiškumo graužikams bandymas (B26);

1.4. Poūmis toksiškumas per virškinimo traktą. Kartotinių dozių 90 dienų toksiškumo ne graužikams bandymas (B27);

1.5. Poūmis toksiškumas per odą. Kartotinių dozių 90 dienų toksiškumo graužikams bandymas (B28);

1.6. Poūmis toksiškumas įkvėpus. Kartotinių dozių 90 dienų toksiškumo graužikams bandymas (B29);

1.7. Lėtinio toksiškumo bandymas (B30);

1.8. Teratogeniškumas graužikams ir ne graužikams (B31);

1.9. Kancerogeniškumas (B32);

1.10. Lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo jungtinis tyrimas (B33);

1.11. Toksiškumo reprodukcijai vienos kartos bandymas (B34);

1.12. Toksiškumo reprodukcijai dviejų kartų bandymas (B35);

1.13. Toksikokinetika (B36);

1.14. Organinių fosforo junginių uždelstas neurotoksiškumas po ūmaus poveikio (B37);

1.15. Organinių fosforo junginių uždelsto neurotoksiškumo 28 dienų bandymas (B38);

1.16. Odos suardymas (B40);

1.17. Fototoksiškumas. 3T3 NRU fototoksiškumo in vitro bandymas (B41).

2. Pavedu ministerijos sekretoriui Eduardui Bartkevičiui kontroliuoti šio įsakymo vykdymą.

SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRASJUOZAS OLEKAS

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos

Ministro 2004 m. liepos 5 d.

įsakymu Nr. V-508

B1³ Metodas: ŪMUS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINimo TRAKTĄ. Ūmaus toksiškumo klasių metodas

I. Bendrosios nuostatos

1. Įvadas

1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 423 metodu.

1.2. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

1.3. Ūmaus toksiškumo klasių metodas teikia informaciją įvertinant riziką ir klasifikuojant.

1.4. Taikant šį metodą naudojamos taip parinktos trys fiksuotos dozės, kad, remiantis bandymų rezultatais, medžiagą būtų galima klasifikuoti. Be to, šis bandymo metodas numato trijų papildomų fiksuotų dozių pasirinkimą; šios dozės gali būti panaudotos kaip alternatyva sprendimui priimti arba kaip prielaida tolesniam bandymui. Papildomos dozės galimos tuo atveju, kai reikia patikslinti rezultatus.

1.5. Metode naudojamos nustatytos pradinės dozės, jis nėra skirtas tiksliam LD₅₀ apskaičiavimui. Šiuo metodu galima nustatyti ekspozicijos trukmę, kai laukiama žūties, nes gyvūnų proporcija ir yra pagrindinis šio bandymo rezultatas. Bandymo rezultatai sudaro pagrindą klasifikuoti pagal nustatytus klasifikavimo kriterijus. Dėl metodo nuoseklumo jo trukmė gali būti ilgesnė. Pagrindinis šio metodo pranašumas tas, kad bandymui reikia mažesnio skaičiaus gyvūnų negu taikant B1²metodą.

2. Apibrėžimai. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Bandymo metodo principas

3.1. Medžiaga nustatytomis dozėmis gyvūnams suleidžiama į virškinimo traktą zondu. Medžiaga bandoma pakopomis, kiekvienoje pakopoje bandant tris vienos lyties gyvūnus. Šiuo atveju nebūtina atlikti įvadinio bandymo. Vienoje pakopoje medžiagos sukelta arba ne gyvūnų žūtis nulemia tolesnį bandymą, t. y.:

3.1.1. tolesni bandymai nereikalingi,

3.1.2. kitas bandymas bus atliktas tą pačią dozę taikant kitos lyties gyvūnams,

3.1.3. kitas bandymas bus atliktas naudojant paeiliui didesnę arba mažesnę dozę.

4. Bandymo metodo aprašymas4.1. Pasiruošimas

4.1.1. Sveiki jauni suaugę gyvūnai atrenkami „aklos atrankos“ metodu, kiekvienas gyvūnas individualiai paženklinamas ir mažiausiai 5 dienas iki bandymo laikomas narvuose bandymo sąlygomis. Gyvūnai gali būti sugrupuoti narvuose pagal lytį ir dozę, bet jų skaičius narve neturi trukdyti atidžiai stebėti kiekvieną gyvūną.

4.1.2. Vienkartinė bandomosios medžiagos dozė suleidžiama tinkamu zondu.

4.1.3. Jeigu reikia, bandomoji medžiaga yra ištirpinama arba išmaišoma tinkamame tirpiklyje. Rekomenduojama naudoti vandeninį tirpalą, jei tai neįmanoma – aliejinį tirpalą, o jei ir tai neįmanoma – rinktis tirpalus kitokiuose tirpikliuose. Jeigu naudojamas nevandeninis tirpiklis, turi būti žinomos jo toksinės savybės, o jeigu jos nežinomos, tai turi būti nustatytos prieš pradedant bandymą.

4.1.4. Prieš suleidžiant medžiagą gyvūnai neturi būti šeriami (žiurkės nešeriamos iš vakaro, pelės prieš 3–4 val.)

4.2. Bandymo sąlygos

4.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai.

4.2.1.1. Jeigu nėra kontraindikacijų, pirmenybė teikiama žiurkėms. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos.

4.2.1.2. Bandymo pradžioje kiekvienos naudojamų gyvūnų lyties kūno masės skirtumai neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamos vidutinės vertės.

4.2.2. Skaičius ir lytis. Kiekvienai pakopai naudojami trys vienos lyties gyvūnai. Pirmoje pakopoje gali būti naudojami bet kurios lyties gyvūnai.

4.2.3. Dozės.

4.2.3.1. Pirmoji dozė parenkama iš trijų pagrindinių fiksuotų dozių (25, 200 arba 2000 mg/kg, toliau – pagrindinės dozės). Pirmoji dozė turi būti tokia, kad sukeltų žūtį mažiausiai keliems gyvūnams. Atsižvelgiant į pirmosios dozės pasirinkimą gali būti panaudojama viena iš srauto diagramų, pateiktų šio metodo 1 priede.

4.2.3.2. Parenkant lytį ir pirmąją dozę, turi būti panaudota visa prieinama informacija, įskaitant ir duomenis apie medžiagos struktūros ir poveikio ryšį. Kai pagal turimą informaciją matyti, kad žūtis netikėtina net esant didžiausiai dozei (2000 mg/kg), tai turi būti atliktas ribinis bandymas. Kai apie bandomąją medžiagą nėra duomenų, rekomenduojama naudoti 200 mg/kg pirmąją dozę.

4.2.3.3. Kai reikia išsamesnės informacijos, negu galima gauti taikant tris pagrindines dozes, bandomos papildomos 5, 50 ar 500 mg/kg fiksuotos dozės.

4.2.3.4. Jeigu žinoma, kad dozės sukels gyvūnams didelį skausmą ir išsekimą dėl ardomojo arba stipraus dirginamojo poveikio, jos neturėtų būti naudojamos.

4.2.3.5. Laiko tarpai tarp poveikių tiriamosioms grupėms nustatomi pagal apnuodijimo požymių atsiradimo pradžią, trukmę ir toksinio poveikio stiprumą. Bandymas netęsiamas su kitos lyties gyvūnais arba naudojant kitą dozę tol, kol bus patikimai nustatytas išgyvenamumas nuo taikomos dozės.

4.2.4. Ribinis bandymas. Ribinis bandymas gali būti atliktas taikant 2000 mg/kg dozę trims kiekvienos lyties gyvūnams. Jeigu medžiaga sukelia žūtį, reikia atlikti 200 mg/kg ar 500 mg/kg dozių bandymus.

4.2.5. Stebėjimo laikotarpis. Stebėjimo laikotarpis turi būti ne trumpesnis kaip 14 dienų. Tačiau stebėjimų trukmė neturėtų būti griežtai nustatoma. Ji turėtų būti nustatoma pagal toksines reakcijas, jų pasireiškimo dažnumą ir sveikimo trukmę; todėl ji gali būti pratęsiama, jeigu tai laikoma reikalinga. Svarbus yra laikas, kada toksiškumas pasireiškia ir išnyksta, ypač jeigu yra toksiškumo požymių atsiradimo vėlavimo tendencija. Visi stebėjimai sistemingai įrašomi į individualias kiekvienam gyvūnui skirtas ataskaitas.

4.3. Bandymo eiga

4.3.1. Kiekvieno gyvūno masė turi būti nustatoma prieš pat bandomos medžiagos suleidimą. Suleidus medžiagą, gyvūnų negalima šerti 3–4 valandas. Jeigu vienetinė dozė buvo suleista dalimis per tam tikrą laikotarpį, gali prireikti gyvūnus šerti ir girdyti, atsižvelgiant į to laikotarpio trukmę.

4.3.2. Maksimalus vienkartinis suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo bandomojo gyvūno masės. Graužikams skysčio tūris neturėtų viršyti 10 ml/kg; tačiau naudojant vandeninį tirpalą jo tūris gali būti 20 ml/kg. Tiriamojo tūrio kitimas turėtų būti minimizuotas taikant tokią koncentraciją, kad būtų užtikrintas pastovus kiekis naudojant visas koncentracijas. Jeigu vienetinės dozės neįmanoma suleisti iškart, ta dozė gali būti duodama mažesnėmis dalimis per 24 valandas.

4.3.3. Darbo eigos schema pateikta šio metodo 1 priede.

4.3.4. Stebėjimai.

4.3.4.1. Kruopšti klinikinė apžiūra turi būti atliekama ne rečiau kaip du kartus dozės suleidimo dieną (arba dažniau, pasireiškus gyvūno atsakui į poveikį), ir po to ne rečiau kaip vieną kartą kiekvieną kitą dieną. Kritę gyvūnai ir gyvūnai su akivaizdžiais skausmo ir išsekimo požymiais turėtų būti humaniškai numarinami. Humaniškai numarinti ir kritę gyvūnai registruojami kaip žuvę eksperimentinių gyvūnų grupėse.

4.3.4.2. Humaniškai numarintų ir kritusių gyvūnų žūties laikas kruopščiai registruojamas. Jeigu gyvūnų apnuodijimo požymiai išlieka, būtini papildomi stebėjimai. Stebėti reikia odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, taip pat ir kvėpavimo, kraujo, periferinės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgsenos pasikeitimus. Ypatingas dėmesys turi būti skiriamas tremorui, konvulsijoms, seilėtekiui, diarėjai, apatiškumui, miegui ir komai.

4.3.4.3. Visi kiekvieno gyvūno stebėjimai yra sistemingai registruojami.

4.3.4.4. Kūno masė. Visi gyvūnai pasveriami prieš pat medžiagos suleidimą ir mažiausiai kas savaitę po suleidimo. Turi būti apskaičiuojami ir registruojami masės skirtumai. Bandymo pabaigoje išgyvenę gyvūnai pasveriami ir humaniškai numarinami.

4.3.4.5. Skrodimas. Visi gyvūnai po bandymo skrodžiami. Registruojami kiekvieno gyvūno skrodimo metu nustatyti patologiniai pokyčiai. Daug svarbios informacijos gali suteikti tų gyvūnų, kurie išgyveno 24 valandas ar ilgiau, organų su dideliais makroskopiniais pokyčiais mikroskopinis tyrimas.

II. DUOMENYS

5. Turi būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to, visi duomenys turi būti apibendrinti lentelėse, nurodant gyvūnų skaičių kiekvienoje grupėje; gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičių; gyvūnų, žuvusių bandymo metu arba humaniškai numarintų, skaičių; kiekvieno gyvūno žūties laiką; apnuodijimo simptomų atsiradimo ir išnykimo aprašymą; skrodimo rezultatus.

6. Rezultatų interpretavimo bendrosios gairės, skirtos klasifikavimui, pateiktos šio metodo 2 priede.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

7.1. Bandymo protokolas. Bandymų protokole turi būti pateikta tokia informacija:

7.1. Bandomieji gyvūnai:

7.1.1. rūšis/veislė;

7.1.2. gyvūnų mikrobiologinė charakteristika, jeigu žinoma;

7.1.3. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;

7.1.4. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir pan.;

7.1.5. kiekvieno gyvūno kūno masė bandymo pradžioje, kiekvieną savaitę ir po bandymo.

7.2. Bandymo sąlygos:

7.2.1. pagrindimas, jeigu tirpikliu pasirinktas ne vanduo;

7.2.2. bandymo medžiagos suleidimo detalūs duomenys, įskaitant tūrius ir dozavimo laiką;

7.2.3. pašarų ir vandens kokybė;

7.2.4. pirmosios dozės parinkimo pagrindimas.

7.3. Rezultatai:

7.3.1. duomenys apie kiekvieno gyvūno atsaką pagal lytį ir dozę (t. y. toksiškumo požymiai, įskaitant žūčių skaičių, jų priežastį, sunkumo laipsnį ir poveikių trukmę) lentelėje;

7.3.2. kiekvienam gyvūnui sukeltų apnuodijimo požymių atsiradimo laikas ir ar jie buvo grįžtami;

7.3.3.turimi kiekvieno gyvūno skrodimo histopatologiniai duomenys.

8. Rezultatų aptarimas.

9. Išvados.

______________

B1³metodas: ūmus toksiškumas per

virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių

metodo

1 priedas

Bandymo PROCEDŪRA

1. Kaip nurodyta šio metodo 4.2.3 punkte, pradinė dozė turi būti tokia, kad sukeltų žūtį mažiausiai keliems gyvūnams. Parenkant pradinę dozę, turi būti žinomi tokie duomenys:

1.1. fizikinės ir cheminės savybės;

1.2. ryšys tarp medžiagos struktūros ir aktyvumo;

1.3. visi kitų toksiškumo tyrimų duomenys;

1.4. tiriamosios medžiagos numanomas panaudojimas.

2. Šiame priede pateiktos atitinkamų bandymų schemos atsižvelgiant į pradinę dozę. Bandymo procedūrų seka nurodoma rodyklėmis, ji priklauso nuo žuvusių ir humaniškai numarintų gyvūnų skaičiaus.

3. Jeigu nuo pradinės 25 mg/kg ar 200 mg/kg dozės žūva tiktai vienas vienos lyties gyvūnas, bandymas toliau netęsiamas. Jeigu kitiems 5 gyvūnams nepasireiškė apnuodijimo požymiai ir žuvusiojo gyvūno skrodimas parodė, kad žūtis nebuvo susijusi su tiriamąja medžiaga, bandymas tęsiamas taikant didesnę dozę.

4. Jeigu nuo 2000 mg/kg dozės žuvo po vieną abiejų lyčių gyvūną, LD₅₀ didesnė už 2000 mg/kg. Kadangi tai yra ribinis rezultatas, likusių dviejų kiekvienos lyties gyvūnų atsakas turi būti gerai išanalizuotas; dideli apnuodijimo požymių skirtumai duoda pagrindą nustatyti LD₅₀ 2000 mg/kg ar mažesnę, arba toliau tirti tą pačią dozę.

5. Taikant šį metodą leidžiama tirti tris papildomas fiksuotas dozes (toliau – papildomos dozės). Papildomos dozės gali būti parenkamos vietoj šio metodo 4.2.3 punkte nurodytų pagrindinių dozių arba, atlikus pagrindinių dozių tyrimą, tolesniam tyrimui. Pagrindinių dozių bandymo procedūrų seka nurodyta storomis rodyklėmis, papildomų dozių – plonomis rodyklėmis.

1 lentelė. Bandymo procedūra, kai pradinė dozė 25 mg/kg kūno masei

2 lentelė. Bandymo procedūra, kai pradinė dozė 200 mg/kg kūno masei

3 lentelė. Bandymo procedūra, kai pradinė dozė 2000 mg/kg kūno masei

______________

B1³ metodas: ūmus toksiškumas per

virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių

metodo

2 priedas

Duomenų, gautų pagal 1 pasirinkimą, interpretacija

Šio priedo schemoje pilkuose stačiakampiuose žemiau įrašo „tolesnių bandymų nereikia“ įrašytos atitinkamomis ribinės dozės klasifikacijai. Atsižvelgiant į bandymo eigą, kaip parodyta 1 pasirinkime, tinkama rodyklė turi būti nukreipta žemyn, nurodant bandymo eigą iki artimiausio pilko stačiakampio su įrašyta konkrečia doze, kuri ir yra dozė klasifikacijai.

1 lentelė. Duomenų, gautų pagal 1 pasirinkimą, interpretacija

Pradinė dozė: 25 mg/kg kūno masei

2 lentelė. Duomenų, gautų pagal 1 pasirinkimą, interpretacija

Pradinė dozė: 200 mg/kg kūno masei

3 lentelė. Duomenų, gautų pagal 1 pasirinkimą, interpretacija

Pradinė dozė: 2000 mg/kg kūno masei

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B9 METODAS: KARTOTINŲ DOZIŲ 28 DIENŲ TOKSIŠKUMAS PER ODĄ

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

2. Apibrėžimai. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Pamatinės medžiagos. Nėra.

4. Bandymo metodo principas. Bandomoji medžiaga kiekvieną dieną dedama ant odos sugrupuotomis dozėmis kelioms eksperimentinių gyvuliukų grupėms, viena dozė – vienai grupei 28 dienų laikotarpiu. Poveikio metu toksiškumo požymiams nustatyti gyvuliukai stebimi kiekvieną dieną. Gyvuliukams, kritusiems bandymo metu, atliekama autopsija, bandymą užbaigus, likusiems gyviems gyvuliukams atliekama autopsija.

5. Kokybės kriterijai. Nėra.

6. Bandymo metodo aprašymas

6.1. Pasiruošimas. Gyvuliukai laikomi eksperimentinėmis gyvenimo ir maitinimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento pradžios. Prieš bandymą sveiki jauni gyvuliukai atrenkami „aklos atrankos“ metodu ir paskiriami į poveikio ir kontrolines grupes. Prieš pat bandymą nuo bandomųjų gyvuliukų nugarinės kūno dalies nukerpama vilna. Galima ir skusti, tai atliekama likus 24 valandoms iki bandymo. Pakartotinai kirpti arba skusti kas savaitę. Kerpant arba skutant vilną, nepažeisti odos. Bandomajai medžiagai uždėti nuskutama ne mažiau kaip 10 proc. kūno paviršiaus. Atsižvelgiama į gyvuliuko kūno svorį, apdangalo dydį, nusprendžiant, kokį plotą reikia turėti be vilnos. Jeigu bandomos kietosios medžiagos, kurios atitinkamais atvejais susmulkinamos, bandomoji medžiaga pakankamai sudrėkinama vandeniu arba atitinkamu tirpikliu, kad būtų užtikrinamas geras sąlytis su oda. Skystos bandomosios medžiagos naudojamos neskiestos. Naudojama kiekvieną dieną nuo penkių iki septynių kartų per savaitę.

6.2. Bandymo sąlygos

6.2.1. Eksperimentiniai gyvuliukai. Naudojamos suaugusios žiurkės, triušiai arba jūrų kiaulytės. Kai naudojamos kitos rūšys, jų naudojimas turi būti pagrįstas. Bandymo pradžioje naudojamų gyvuliukų svorio pakitimo intervalas neturi viršyti 20 proc. atitinkamos vidutinės vertės.

6.2.2. Skaičius ir lytis. Kiekvienai dozei naudojama ne mažiau kaip 10 gyvuliukų (penkios patelės ir penki patinėliai) su sveika oda. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Jeigu planuojami tarpiniai numarinimai, gyvuliukų skaičius padidinamas tokiu gyvuliukų skaičiumi, kuris buvo planuojamas numarinti iki bandymo pabaigos. Be to, papildoma 10 gyvuliukų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvuliukus) paveikiama didele doze 28 dienas ir stebimi grįžtamumo, išsilaikymo arba užtrukusio pasireiškimo poveikiai 14 dienų po poveikio. Taip pat naudojama papildoma kontrolinė 10 gyvuliukų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvuliukus).

6.2.3. Dozės

6.2.3.1. Reikalingos ne mažiau kaip trys dozės kontrolės arba tirpiklio kontrolės, jeigu naudojamas tirpiklis. Poveikio laikas ne trumpesnis kaip šešios valandos per dieną. Bandomoji medžiaga uždedama tuo pačiu laiku kiekvieną dieną ir intervalai (kas savaitę arba kas dvi savaites) suderinami taip, kad gyvuliuko kūno svorio atžvilgiu būtų išlaikoma pastovi dozė. Išskyrus tuos atvejus, kai paveikiama bandomąja medžiaga, su kontrolinės grupės gyvuliukais elgiamasi taip pat, kaip ir su bandomosios grupės objektais. Jeigu dozavimui palengvinti naudojamas tirpiklis, kontrolinės grupės dozuojamos su tirpikliu taip pat, kaip ir bandomosios grupės, ir turi gauti tokį patį kiekį tirpiklio, kurį gauna didžiausios dozės grupė. Didžiausia dozė turi sukelti toksiškumo poveikius, bet ne mirtį arba tik kelis tokius atvejus. Mažiausia dozė neturi sukelti jokių toksiškumo požymių. Jeigu yra tinkamas poveikio žmogui įvertinimas, mažiausia dozė jį turi viršyti. Geriausia, jeigu vidutinė dozė gali sukelti mažiausius stebimus toksiškumo poveikius. Jeigu naudojama daugiau negu viena tarpinė dozė, dozės išskirstomos intervalais taip, kad susidarytų toksiškų poveikių intensyvumo vertinimo skalė. Mažų ir tarpinių dozių bei kontrolinėse grupėse mirties atvejų dažnumas turi būti žemas, kad būtų galima įvertinti rezultatus.

6.2.3.2. Jeigu bandomoji medžiaga sukelia stiprų odos dirginimą, koncentracijos sumažinamos, todėl naudojant dideles dozes turi susilpnėti kiti toksiški poveikiai arba jų nebūti. Be to, jeigu oda labai stipriai pažeidžiama, reikalinga bandymą nutraukti ir pradėti naują bandymą su mažesnėmis koncentracijomis.

6.2.4. Ribinis bandymas. Jeigu išankstinis bandymas su 1000 mg/kg doze arba didesne doze, susijusia su tikėtinu poveikiu žmogui, ir žinoma, kad nesukelia akivaizdžių toksiškumo poveikių, bandymo tęsti nereikia.

6.2.5. Stebėjimo laikotarpis. Kiekvieną dieną stebima, ar eksperimentiniams gyvuliukams nepasireikš toksiškumo požymiai. Registruojamas mirties laikas ir laikas, kada pasireiškė ir išnyko toksiškumo požymiai.

6.3. Darbo eiga

6.3.1. Gyvuliukai laikomi atskiruose narveliuose. Jie paveikiami bandomąja medžiaga, septynias dienas per savaitę 28 dienų laikotarpiu. Gyvuliukai iš bet kurios pagalbinės grupės, suskirstyti uždelstų rezultatų stebėjimams, laikomi dar 14 dienų be poveikio, kad būtų nustatomas atsigavimas po toksiškų poveikių arba jų išlikimas. Poveikio laikas neturi būti trumpesnis kaip šešios valandos per dieną.

6.3.2. Bandomoji medžiaga tolygiai uždedama ant plotelio, kurio dydis sudaro apie 10 proc. viso kūno paviršiaus. Jeigu medžiagos labai toksiškos, paveikiamas paviršius gali būti mažesnis, bet kaip galima didesnis plotas padengiamas kiek įmanoma plonesniu ir vienodu sluoksniu.

6.3.3. Bandomoji medžiaga turi liestis su oda akytu marliniu tvarsčiu ir nedirginančia lipnia juostele. Tiriamoji vieta atitinkamai padengta, kad būtų išsaugotas marlinis tvarstis ir tiriamoji medžiaga, bei užtikrinama, kad gyvuliukai neprarys bandomosios medžiagos. Gali būti naudojami ribotuvai, kad tiriamoji medžiaga nebūtų praryjama, bet visiško imobilizavimo metodas nerekomenduojamas. „Apsauginės apykaklės metodas“ gali būti naudojamas kaip alternatyva.

6.3.4. Poveikio laikotarpio pabaigoje bandomosios medžiagos likutis pašalinamas, jeigu praktiškai įmanoma, naudojant vandenį ar kokį kitą atitinkamą odos valymo būdą.

6.3.5. Visi gyvuliukai stebimi kiekvieną dieną, o toksiškumo požymiai registruojami nurodant pasireiškimo laiką, jų laipsnį ir trukmę. Stebėjimai turi apimti odos ir kailio, akių ir akies gleivinės pokyčius, taip pat kvėpavimo, kraujo apytakos, vegetacinės ir centrinės nervų sistemų pokyčius, somatomotorinės veiklos ir elgsenos sutrikimus. Kiekvieną savaitę nustatomas gyvuliukų svoris. Taip pat kiekvieną savaitę matuojamas suvartoto maisto kiekis. Reguliarus gyvuliukų stebėjimas yra reikalingas, kad būtų užtikrinama, jog, kiek įmanoma, bus stengiamasi neprarasti gyvuliukų dėl tokių priežasčių, kaip kanibalizmo, audinių autolizės arba dėl netinkamo metodo taikymo. Bandymo laikotarpio pabaigoje išlikusiems gyviems iš nepagalbinio poveikio grupių gyvuliukams atliekama autopsija. Krentantys gyvuliukai ir gyvuliukai, kenčiantys sunkias kančias ar skausmą, kai tai pastebima, pašalinami, humaniškai numarinami, ir atliekama autopsija.

6.3.6. Bandymo metu visiems gyvuliukams, taip pat ir kontroliniams atliekami šie tyrimai:

6.3.6.1. hematologija, bent jau kraujo kūnelių, hemoglobino koncentracijos, eritrocitų kiekio apskaičiavimas, visas ir diferencinis leukocitų kiekis ir krešėjimo matavimas;

6.3.6.2. klinikinė kraujo biochemija, taip pat įtraukiant ne mažiau kaip vieną kepenų ir inkstų funkcijų parametrą: alanino aminotransferazės serumas (anksčiau žinomas kaip glutamo piruvo transaminazė), aspartato aminotransferazės serumas (anksčiau žinomas kaip glutamo oksalato transminazė), šlapimo azotas, albuminas, kraujo kreatininas, visas bilirubino kiekis ir visas serumo proteinų kiekis.

6.3.7. Į kitus nustatymus, kurie reikalingi kompetentingam toksikologiniam įvertinimui atlikti, įeina kalcio, fosforo, chloro, natrio, kalio, badavimo gliukozės nustatymas, lipidų, hormonų, rūgščių/šarmų pusiausvyros, methemoglobino, cholinesterazės veiklos analizė.

6.3.8. Atitinkamais atvejais naudojama papildoma klinikinė biochemija stebėtų toksiškumo poveikių tyrinėjimui išplėsti.

6.4. Bendroji autopsija. Visiems bandymo gyvuliukams atliekama visa bendroji autopsija. Kepenys, inkstai, antinksčiai ir sėklidės, kad neišdžiūtų, pasveriami drėgni tuojau pat po skrodimo. Organai ir audiniai (tai organai, kuriuose stebimi dideli organų pakenkimai arba dydžio pakitimai) konservuojami atitinkamoje terpėje galimam histopatologiniam ištyrimui ateityje.

6.5. Histopatologinis tyrimas. Didelių dozių grupėje ir kontrolinėje grupėje atliekamas užkonservuotų organų ir audinių histologinis ištyrimas. Organai ir audiniai su tiriamajai medžiagai priskirtinais defektais, kuri įvesta didžiausiomis dozėmis, ištiriami visose mažesnių dozių grupėse. Papildomos grupės gyvuliukai ištiriami histologiškai, ypatingą dėmesį skiriant tiems organams ir audiniams, jeigu nustatyta, kad kitose paveiktose grupėse tie poveikiai pasireiškė.

II. DUOMENYS

7. Duomenys apibendrinami lentelėse kiekvienai bandomai grupei nurodant gyvuliukų skaičių bandymo pradžioje ir gyvuliukų, kuriems pasireiškė kiekvienos rūšies pakenkimai, skaičių.

8. Visi stebėti rezultatai įvertinami naudojant atitinkamą statistikos metodą. Naudojamas bet kuris pripažintas statistikos metodas.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

9. Bandymo protokolas. Bandymo protokole, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:

9.1. duomenys apie gyvuliukus (rūšis, linija, gyvuliukų tiekėjas, aplinkos sąlygos, dieta ir pan.);

9.2. bandymo sąlygos (taip pat tvarsčių rūšis: uždari ar neuždari);

9.3. dozės (taip pat tirpiklio, jeigu naudotas) ir koncentracijos;

9.4. poveikio nesukeliančios dozės, jeigu įmanoma;

9.5. duomenys apie toksiškumo atsakus pagal lytį ir dozę;

9.6. mirties laikas bandymo metu arba nurodant, ar gyvuliukas išgyveno iki pabaigos;

9.7. toksiški arba kitokie poveikiai;

9.8. laikas, kada buvo pastebėtas kiekvienas nenormalus požymis ir tolesnė jo eiga;

9.9. duomenys apie maistą ir kūno svorį;

9.10. naudoti hematologiniai bandymai ir jų rezultatai;

9.11. naudoti klinikiniai biocheminiai bandymai ir jų rezultatai;

9.12. autopsijos duomenys;

9.13. išsamus visų histopatologinių duomenų aprašymas;

9.14. statistinis duomenų apdorojimas, jeigu įmanomas;

9.15. duomenų aptarimas;

9.16. duomenų aiškinimas.

10. Duomenų apskaičiavimas ir aiškinimas. Šio metodo duomenų apskaičiavimas ir aiškinimas pateiktas Bendrajame įvade.

IV. NUORODOS

11. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade.

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B26 Metodas: poūmis toksiškumas per virškinimo traktą. KARTOTINIŲ DOZIŲ 90 DIENŲ TOKSIŠKUMo GRAUŽIKAMS bandymas

I. bendrosios nuostatos

1. Įvadas

1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 408 metodu.

1.2. Vertinant cheminių medžiagų toksinį poveikį, poūmis toksiškumas per virškinimo traktą gali būti nustatomas tik po to, kai yra duomenų apie ūmų arba poūmį 28 dienų toksiškumo poveikį. 90 dienų bandymas teikia informaciją apie galinčią atsirasti riziką sveikatai esant ilgalaikei kartotinei ekspozicijai, apimančiai brendimą ir augimą. Šis bandymas teikia informaciją apie didžiausius toksinius poveikius, nustato organą-taikinį ir kaupimosi galimybes, sudaro pagrindą apskaičiuoti NOAEL, kuris taikomas ilgalaikiuose bandymuose nustatant saugos kriterijus žmogaus sveikatai.

1.3. Metodas pabrėžia neurologinį poveikį ir parodo poveikį imuninei ir reprodukcinei sistemoms. Ypatingas dėmesys skiriamas kruopščių klinikinių stebėjimų būtinumui. Šiuo metodu nustatomas galimas cheminės medžiagos neurotoksinis poveikis, o tai sudaro prielaidą planuoti išsamesnį medžiagos tyrimą. Be to, šiuo metodu galima gauti duomenų apie tiriamosios medžiagos poveikį imuninei sistemai ir reprodukcijai.

2. Apibrėžimai. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

3. Bandymo metodo principas. Medžiaga nustatytomis dozėmis kasdien gyvūnams zondu suleidžiama į virškinimo traktą, viena koncentracija naudojama vienai grupei 90 dienų. Medžiagos poveikio laikotarpiu gyvūnai stebimi kiekvieną dieną toksiškumo požymiams nustatyti. Kritusiems bandymo metu ir išgyvenusiems gyvūnams po bandymo atliekama autopsija.

4. Bandymo metodo aprašymas

4.1. Pasiruošimas. Sveiki jauni suaugę gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į kontrolinę ir bandomąsias grupes. Narvai turi būti išdėstyti taip, kad būtų sumažintas galimas poveikis bandymo rezultatams. Kiekvienas gyvūnas individualiai paženklinamas ir mažiausiai penkias dienas iki bandymo pradžios laikomas narve bandymo sąlygomis. Negalima naudoti kituose bandymuose tirtus gyvūnus. Bandymo gyvūnai turi būti rūšiuojami pagal rūšį, veislę, gyvūnų tiekėją, lytį, masę ir/arba amžių.

4.2. Dozių paruošimas

4.2.1. Bandomoji medžiaga gyvūnams suleidžiama į virškinimo traktą zondu arba duodama šeriant arba girdant vandeniu. Medžiagos suleidimo į virškinimo traktą būdas parenkamas atsižvelgiant į bandymo tikslą ir medžiagos fizines bei chemines savybes.

4.2.2. Jei reikia, bandomoji medžiaga yra ištirpinama arba išmaišoma tinkamame tirpiklyje. Rekomenduojama naudoti vandeninį tirpalą, jei tai neįmanoma – aliejinį tirpalą, o jei ir tai neįmanoma – rinktis tirpalus kitokiuose tirpikliuose. Jeigu naudojamas nevandeninis tirpiklis, turi būti žinomos jo toksinės savybės ir bandomosios medžiagos stabilumas šiame tirpiklyje.

4.3. Bandymo sąlygos

4.3.1. Eksperimentiniai gyvūnai. Pirmenybė teikiama žiurkėms, nors gali būti naudojamos ir kitos graužikų rūšys, pvz., pelės. Dažniausiai naudojamos sveikų jaunų suaugusių gyvūnų įprastos laboratorinės veislės. Jeigu naudojamos patelės, jos turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Bandomoji medžiaga gali būti suleidžiama tuoj po nujunkymo, bet ne vėliau nei gyvūnams sueina devynios savaitės. Bandymo pradžioje gyvūnų masės skirtumai neturi viršyti ± 20 % atitinkamos vidutinės vertės kiekvienai lyčiai. Jeigu kartotinių dozių bandymas per virškinimo traktą atliekamas kaip įvadinis bandymas prieš pagrindinį bandymą, tai abiejuose bandymuose turi būti naudojami tos pačios veislės ir to paties tiekėjo gyvūnai.

4.3.2. Skaičius ir lytis. Kiekvienai medžiagos koncentracijai naudojami ne mažiau kaip dvidešimt gyvūnų (dešimt patinų ir dešimt patelių). Jeigu bandymo metu planuojama numarinti dalį gyvūnų, jų pradinis skaičius turi būti didesnis tiek, kiek planuojama gyvūnų numarinti prieš bandymo pradžią. Be to, gali būti naudojama 10 gyvūnų (penki patinai ir penkios patelės) papildoma kontrolės grupė, kuri 90 dienų gauna dideles dozes siekiant nustatyti atsako grįžtamumą arba vėlavimą po poveikio pabaigos. Stebėjimo laikotarpis pasibaigus bandymui nustatomas pagal aptiktus toksiškumo požymius.

4.3.3. Dozės

4.3.3.1. Iš viso naudojamos mažiausiai trys bandymo grupės ir viena kontrolinė, išimtį sudaro ribinis bandymas (1.4.3.4). Dozės turi būti parenkamos atsižvelgiant į turimus bandomosios ar jai giminingos medžiagos toksiškumo ir toksikokinetikos duomenis. Didžiausia dozė, kurią riboja bandomosios medžiagos fizikinės ir cheminės savybės bei biologinis poveikis, parenkama atsižvelgiant į toksinio poveikio, bet ne į žūties ar didelių kančių sukėlimo galimybę. Po to parenkama mažėjančių dozių eilė, kad būtų nustatytas atsakas į skirtingų dozių poveikį, bei dozė, nesukelianti pastebimo žalingo poveikio (NOAEL). Dozės parenkamos taip, kad viena nuo kitos skirtųsi du keturis kartus. Kai didžiausia ir mažiausia dozė skiriasi daugiau kaip 6–10 kartų, patartina naudoti papildomą ketvirtąją bandomųjų gyvūnų grupę.

4.3.3.2. Kontrolinės grupės gyvūnai laikomi tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir bandomieji gyvūnai, išskyrus poveikį bandomąja medžiaga. Jei bandomajai medžiagai naudojamas tirpiklis, tai kontrolinės grupės gyvūnai turi gauti didžiausią tiriamajai grupei panaudotą tirpiklio tūrį. Kai bandomoji medžiaga duodama šeriant ir gyvūnai mažiau suėda pašarų; tai vertinant pašarų sunaudojimą kontrolinėje grupėje atsižvelgiama į dėl pašaro sumažėjimo nepriimtinumo ar toksinio poveikio bandymo modelyje.

4.3.3.3. Būtina atkreipti dėmesį į dominančias tirpiklio savybes bei kitus lydimuosius reiškinius, pvz., poveikis absorbcijai, pasiskirstymas, metabolizmas arba bandomosios medžiagos kaupimasis; poveikis tiriamosios medžiagos cheminėms savybėms, kuris gali pakeisti jos toksines savybes; poveikis pašaro ar vandens suvartojimui arba gyvūnų mitybos būklei.

4.3.4. Ribinis bandymas. Jeigu bandymas su mažiausia 1000 mg/kg/d doze pagal aprašytą procedūrą nesukelia NOAEL ir jeigu pagal turimus duomenis apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, tai nebūtina atlikti viso bandymo su trimis dozėmis, išskyrus tuos atvejus, kai dėl numanomo poveikio žmogui reikia tirti didesnes dozes.

5. Bandymo eiga

5.1. Dozių suleidimas

5.1.1. Gyvūnams bandomoji medžiaga duodama kiekvieną dieną 90 dienų; taikomas penkių dienų per savaitę dozavimas turi būti pagrįstas. Vienkartinė bandomosios medžiagos koncentracija suleidžiama zondu. Maksimalus vienkartinis suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio, bandomosios medžiagos tirpalo tūris neturi viršyti 10 ml/kg, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių gali būti suleidžiama 20 ml/kg. Bandomojo tūrio kitimas turi būti sumažintas taikant tokią koncentraciją, kad būtų užtikrintas pastovus kiekis naudojant visas koncentracijas. Išimtį sudaro dirginančios ir ėsdinančios medžiagos, kurių įprastos koncentracijos sukelia sunkius poveikius.

5.1.2. Kai bandomoji medžiaga patenka su pašarais arba vandeniu, svarbu užtikrinti, kad ji nekliudytų įprastinio šėrimo arba girdymo. Kai bandomoji medžiaga pateikiama su pašarais, ji dozuojama pastovia koncentracija (dpm) arba pastovia doze, apskaičiuojama gyvūno kūno masei; gali būti taikomi alternatyvūs metodai, kurie turi būti aprašyti. Kai medžiaga suleidžiama per zondą, dozė teikiama tuo pačiu metu kiekvieną dieną, norint palaikyti pastovią medžiagos koncentraciją gyvūno masės vienetui. Kai 90 dienų bandymas atliekamas kaip įvadinis į ilgalaikį toksiškumo bandymą, abiem atvejais taikomas vienodas šėrimas.

5.2. Stebėjimai

5.2.1. Stebėjimo laikotarpis turi būti mažiausiai 90 dienų. Papildomos grupės gyvūnai turi būti suskirstyti tolesniems stebėjimams ir turi būti laikomi tinkamą laiko tarpą be poveikio, siekiant išaiškinti toksinių požymių atsiradimą arba išnykimą.

5.2.2. Kruopšti klinikinė apžiūra turi būti atliekama mažiausiai kartą per dieną, geriausiai tuo pačiu metu, atsižvelgiant į laukiamų poveikių piką. Gyvūnų sveikatos būklė turi būti registruojama. Mažiausiai du kartus per dieną visi gyvūnai turi būti patikrinami, nustatant žuvimą ir apnuodijimą.

5.2.3. Sergantys ir su akivaizdžiais skausmo ar išsekimo požymiais gyvūnai turi būti iškeliami iš narvų, pažymimi, humaniškai numarinami ir skrodžiami. Prieš pradedant bandymą, kartą per savaitę, atliekama visų gyvūnų kruopšti klinikinė apžiūra. Apžiūrima vienodomis sąlygomis, išėmus iš narvo, tuo pačiu laiku. Rezultatai tiksliai įrašomi į stebėjimo žurnalą, įvertinant balų sistema, naudojama bandymo laboratorijoje. Turi būti užtikrintas bandymo sąlygų pastovumas. Patartina, kad stebėjimus atliktų kiti tyrėjai, o ne tie, kurie suleidžia gyvūnams bandomąją medžiagą. Stebimi ir užrašomi odos, vilnos, akių, gleivinės pakitimai, akių išskyros, periferinės veiklos (pvz., ašarojimo, plaukų pašiaušimo, vyzdžio dydžio, neįprastų kvėpavimo požymių) pakitimai. Registruojami eisenos, pozos, reakcijos į paėmimą rankomis pakitimai, kloninių ar toninių traukulių atsiradimas, elgsenos stereotipai (pvz., besaikis valymasis, pasikartojantis sukimasis ratu) bei keista (pvz., savęs luošinimas, vaikščiojimas atbulomis) elgsena.

5.2.4. Ketvirtą poveikio savaitę įvertinamas jautrumas skirtingų tipų dirgikliams (pvz., klausos, regėjimo ir proprioreceptiniams), griebimo stiprumas bei motorinis aktyvumas. Detalesnį eigos aprašymą galima surasti literatūroje (žiūrėti šio metodo Bendrąjį įvadą).

5.2.5. Funkciniai stebėjimai ketvirtą savaitę neatliekami, jeigu bandymas yra įvadinis prieš tolesnį 90 dienų bandymą. Tokiu atveju funkciniai stebėjimai atliekami tolesnio bandymo metu. Funkciniai stebėjimai padidina galimybę geriau parinkti dozę tolesniam 90 dienų tyrimui.

5.2.6. Išimtiniais atvejais funkciniai stebėjimai neatliekami tų gyvūnų grupių, kuriose nustatyti didelio toksiškumo požymiai, trukdantys atlikti funkcinius tyrimus.

5.3. Kūno masė ir pašarų bei vandens suvartojimas. Vieną kartą per savaitę visi gyvūnai sveriami, nustatomas pašarų suvartojimas. Jeigu bandomoji medžiaga yra duodama su geriamuoju vandeniu, vandens suvartojimas taip pat matuojamas ne rečiau kaip kartą per savaitę.

5.4. Hematologija ir klinikinė biochemija

5.4.1. Bandymo pabaigoje nustatomi šie hematologiniai rodikliai: hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocitų kiekis, leukocitų formulė ir bendras kiekis, trombocitų kiekis ir kraujo krešėjimo trukmė. Kraujo bandiniai paimami iš nustatytų vietų prieš gyvūno numarinimą arba numarinimo metu ir tinkamai saugomi iki biocheminių tyrimų atlikimo.

5.4.2. Biocheminiai tyrimai atliekami vertinant pagrindinius toksinius poveikius audiniams, ypač inkstams ir kepenims. Rekomenduojama nešerti gyvūnų iš vakaro, jeigu ryte numatoma paimti kraujo bandinį. Kraujo plazmoje arba serume tiriami šie rodikliai: natris, kalis, gliukozė, bendrasis cholesterolis, karbamidas, kreatininas, bendrasis baltymas ir albuminas, mažiausiai du fermentai, rodantys poveikį kepenų ląstelėms (tokie kaip šarminė fosfatazė, alaninaminotransferazė, aspartataminotransferazė, gamaglutamiltranpeptidazė ir sorbitoldehidrogenazė). Tam tikromis aplinkybėmis papildomi fermentų (kepenų ar kitos kilmės) ir tulžies rūgščių tyrimai gali suteikti naudingos informacijos. Paskutinę bandymo savaitę atliekami tokie šlapimo tyrimai: šlapimo tūris, surinktas per nurodytą laikotarpį, jo išvaizda, kvapas, lyginamasis svoris, pH, baltymai, gliukozė ir kraujo ląstelės; bet šis tyrimas nėra privalomas.

5.4.3. Galima atlikti papildomus serumo rodiklių, rodančių pagrindinių audinių pažeidimus, tyrimus. Jeigu žinomas ar įtariamas tiriamosios medžiagos poveikis organizmo medžiagų apykaitai, tiriamas kalcio, fosforo, trigliceridų, specifinių hormonų, methemoglobino bei cholinesterazės kiekis kraujyje. Šie rodikliai nustatomi tiriant tam tikras medžiagas arba esant indikacijoms.

5.4.4. Tirtini biocheminiai rodikliai parenkami atsižvelgiant į gyvūnų rūšį ir stebėjimų duomenis bei bandomosios medžiagos laukiamą poveikį. Jeigu turimi duomenys apie medžiagą yra prieštaringi, prieš pradedant bandymą nusprendžiama, kokie hematologiniai ir biocheminiai rodikliai bus tiriami.

5.4.5. Kai kuriems serumo ir plazmos tyrimams, ypač dėl gliukozės, ypač svarbu gyvūnų šėrimas iš vakaro. Šėrimas prieš bandymą veikia tiriamų rodiklių svyravimus ir apsunkina duomenų interpretavimą, pakeičia gyvūnų bendrą medžiagų apykaitą, o ypač mitybos tyrimuose gali pakeisti bandomosios medžiagos poveikį. Jei nuspręsta gyvūnus šerti iš vakaro, tai klinikiniai biocheminiai tyrimai atliekami tik ketvirtą tyrimų savaitę, atlikus funkcinius stebėjimus.

5.5. Skrodimas

5.5.1. Visi gyvūnai po bandymo skrodžiami. Registruojami kiekvieno gyvūno skrodimo metu nustatyti kūno paviršiaus, visų angų, kaukolės, krūtinės ląstos, pilvo ertmės ir jos turinio patologiniai pokyčiai. Visų gyvūnų kepenys, inkstai, antinksčiai, sėklidės ir jos prielipas, užkrūčio liauka, blužnis, smegenys bei širdis nuvalomi, kad neliktų pašalinių audinių, kuo greičiau pasveriami ir tinkamai paruošiami laikymui.

5.5.2. Organai laikomi terpėje, kuri tinka šiam organui laikyti ir nekeičia jo savybių histopatologinių tyrimų metu. Histopatologiškai tiriami: bendri pakitimai, smegenys (didieji pusrutuliai, smegenėlės ir kamienas), nugaros smegenys, skrandis, plonoji ir storoji žarna (įskaitant Peyerio plokšteles), kepenys, inkstai, antinksčiai, blužnis, širdis, užkrūčio liauka, skydliaukė, trachėja ir plaučiai (įleidžiant fiksuojamosios medžiagos, o po to panardinant), lyties liaukos, gimda, prostata, šlapimo pūslė, limfiniai mazgai (vienas limfinis mazgas turi atspindėti medžiagos patekimo būdą, o kitas, esantis toliau, – sisteminius poveikius), esantis arčiau raumens periferinis nervas (sėdimasis arba blauzdikaulio) bei kaulų čiulpai (arba šviežiai paruošta kaulų čiulpų punkcija). Atsižvelgiant į gautus klinikinius ir kitus duomenis gali prireikti tirti papildomus organus. Be to, galimam tolesniam tyrimui turi būti laikomi visi organai, kurie gali būti bandomosios medžiagos poveikio taikiniai atsižvelgiant į jos žinomas savybes.

5.6. Histopatologinis tyrimas

5.6.1. Visapusiškas histopatologinis įvertinimas atliekamas visų kontrolinės ir didžiausią dozę gavusių grupių gyvūnų organų ir audinių. Jeigu didžiausią dozę gavusių gyvūnų grupėje dėl medžiagos poveikio atsirado pakitimų, histopatologiškai ištirti privalu ir kitų grupių gyvūnus. Įvertinami visi bendrieji pažeidimai.

5.6.2. Papildomos grupės gyvūnų pažeisti audiniai ir organai histopatologiškai ištiriami.

II. DUOMENYS

6. Apibendrinti gyvūnų duomenys pateikiami lentelėse, nurodant kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičių bandymo pradžioje; gyvūnų, žuvusių bandymo metu ar humaniškai numarintų, skaičius; gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičius; kiekvieno gyvūno žūties ar numarinimo laikas; pastebėtų toksinio poveikio požymių apibūdinimas, įskaitant atsiradimo laiką, trukmę ir sunkumą; gyvūnų su pažeidimais skaičius, pažeidimų tipas ir gyvūnų su įvairių tipų pažeidimais procentas.

7. Jeigu įmanoma, skaitmeniniai duomenys apdorojami tinkamais statistiniais metodais, kurie parenkami planuojant bandymą.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

8. Bandymo protokolas. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:

8.1. Bandomieji gyvūnai:

8.1.1. rūšis, veislė;

8.1.2. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;

8.1.3. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir pan.;

8.1.4. kiekvieno gyvūno kūno masė bandymo pradžioje, kiekvieną savaitę ir po bandymo.

8.2. Bandymo sąlygos:

8.2.1. pagrindimas, jeigu tirpikliu pasirinktas ne vanduo;

8.2.2. koncentracijų parinkimo paaiškinimas;

8.2.3. detalūs duomenys apie tiriamosios medžiagos receptūrą, paruošimą maišant su pašaru, preparato koncentraciją, stabilumą ir homogeniškumą;

8.2.4. bandymo medžiagos suleidimo detalūs duomenys;

8.2.5. bandomosios medžiagos koncentracijos pašare, vandenyje (md) perskaičiavimas į faktišką dozę (mg/kg/d), jeigu įmanoma;

8.2.6. pašaro ir vandens kokybė.

8.3. Duomenys:

8.3.1. kūno masė ir kūno masės pokyčiai;

8.3.2. pašaro ir vandens suvartojimas, jeigu įmanoma;

8.3.3. duomenys apie atsaką į toksinį poveikį, įskaitant toksiškumo požymius, pagal lytį ir dozę;

8.3.4. atsakų pobūdis, sunkumo laipsnis, trukmė ir grįžtamumas;

8.3.5. jautrumo, griebimo stiprumo ir motorinio aktyvumo įvertinimas;

8.3.6. hematologiniai tyrimai, palyginti su norma;

8.3.7. biocheminiai tyrimai, palyginti su norma;

8.3.8. kūno ir organų masė žuvimo metu;

8.3.9. skrodimo duomenys;

8.3.10. detalus histopatologinių pokyčių aprašymas;

8.3.11. absorbcijos duomenys, jeigu yra;

8.3.12. statistinis rezultatų apdorojimas, kai tinka.

9. Duomenų aptarimas.

10. Išvados.

IV. NUORODOS

11. CSTP (1986). Principai ir metodai neurotoksiškumui, susijusiam su chemikalų poveikiu, įvertinti. Aplinkos sveikatos kriterijų dokumentas Nr. 60.

12. Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Neurologinių tyrimų žiurkėse nauda. Acta Neurobiol. Leid., 40, 999–1003.

13. Gad, S. C. (1982). Neuromuskuliarinis ekranas naudojimui pramoninėje toksikologijoje. J. Toxicol. Environ. Health, 9 t., 691–704.

14. Moser, V. C., Mc Daniel, K. M., Philips, P. M. (1991). Žiurkių veislės ir rūšies palyginimas naudojant funkcinio stebėjimo įrangą: išeities vertės ir taikių santykių poveikis. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108 t., 267–283.

15. Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C., Riley M. T. (1979). Rutininis metodas žiurkių ir pelių priekinių ir užpakalinių galūnių sukibimo jėgai įvertinti. Neurobehav. Toxicol., 1t., 233–236.

16. Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C., Gill M. W., Reiter L. W., Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991). Judesio aktyvumo eksperimentų tarplaboratorinis palyginimas: įdiegimas neurotoksiniam įvertinimui. Neurotoxikol. Teratol., 13t., 599–609.

17. Weingang K., Brown G., Hall R. Ir kt. (1996). Gyvūnų klinikinės patologijos bandymų harmonizavimas toksiškumo ir saugos tyrimuose. Fundam. & Appl. Toxicol. 29 t., 198–201.

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos

ministro 2004 m. liepos 5 d.

įsakymu Nr. V-508

B27 METODAS: poūmis toksiškumas per virškinimo traktą. KARTOTINIŲ DOZIŲ 90 DIENŲ TOKSIŠKUMO ne GRAUŽIKAMS BANDYMAS

I. bendrosios nuostatos

1. Įvadas

1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 409 metodu.

1.3. Metodas suteikia galimybes nustatyti neigiamus cheminių medžiagų poveikius negraužikams ir taikytinas šiais atvejais:

1.3.1. kai gauti bandymų rezultatai turi būti išaiškinti arba apibūdinti atsižvelgiant į antros, negraužikų rūšies bandymo rezultatus,

1.3.2. kai toksikokinetinio bandymo metu nustatoma, kad specifinės negraužikų rūšies panaudojimas yra tinkamiausias laboratorinio gyvūno pasirinkimas, arba

1.3.3. kai kitos specifinės priežastys lemia negraužikų rūšies panaudojimą,

1.3.4. šio metodo pamatinė informacija pateikta Bendrajame įvade.

2. Apibrėžimai. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Bandymo metodo principas. Medžiaga nustatytomis dozėmis kasdien gyvūnams zondu suleidžiama į virškinimo traktą, viena koncentracija naudojama vienai grupei 90 dienų. Medžiagos poveikio laikotarpiu gyvūnai stebimi kiekvieną dieną toksiškumo požymiams nustatyti. Žuvusiems bandymo metu ir išgyvenusiems gyvūnams, juos numarinus, po bandymo atliekamas skrodimas.

4. Bandymo metodo aprašymas

4.1. Gyvūnų rūšies parinkimas. Paprastai negraužikų rūšis yra tam tikros veislės, dažniausiai skalikų, šuo. Kitos rūšys: kiaulės, kiaulytės, taip pat gali būti panaudojami. Nerekomenduotina naudoti primatus, jų naudojimas turi būti įteisintas. Bandymui naudoja jaunus sveikus gyvūnus, šunų atveju dozavimas turi prasidėti, kai jų amžius yra 4–6 mėnesiai, bet ne vėliau kaip 9 mėnesiai. Jeigu kartotinių dozių bandymas per virškinimo traktą atliekamas kaip įvadinis bandymas prieš pagrindinį, tai abiejuose bandymuose turi būti naudojami tos pačios veislės ir to paties tiekėjo gyvūnai.

4.2. Gyvūnų paruošimas. Sveiki jauni gyvūnai, kurie nebuvo tiriami kituose bandymuose, aklimatizuojami laboratorijos sąlygoms. Aklimatizacijos laikas priklauso nuo parinktos rūšies ir tiekimo šaltinio. Šunims arba specialiai išaugintoms kiaulėms rekomenduojama mažiausiai 5 dienų, bet jeigu šie gyvūnai gauti iš aplinkos šaltinių, tai jiems rekomenduotina mažiausiai 2 savaičių aklimatizacija. Bandymo gyvūnai turi būti rūšiuojami pagal rūšį, veislę, gyvūnų tiekėją, lytį, masę ir/arba amžių. Gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į kontrolinę ir bandomąsias grupes. Narvai turi būti išdėstyti taip, kad būtų sumažintas galimas poveikis bandymo rezultatams. Kiekvienas gyvūnas individualiai paženklinamas.

4.3 Dozių paruošimas

4.3.1. Bandomoji medžiaga gyvūnams suleidžiama į virškinimo traktą zondu arba duodama šeriant arba girdant vandeniu. Medžiagos suleidimo į virškinimo traktą būdas parenkamas atsižvelgiant į bandymo tikslą ir medžiagos fizines bei chemines savybes.

4.3.2. Jei reikia, bandomoji medžiaga yra ištirpinama arba išmaišoma tinkamame tirpiklyje. Rekomenduojama naudoti vandeninį tirpalą, jei tai neįmanoma – aliejinį tirpalą, o jei ir tai neįmanoma – rinktis tirpalus kitokiuose tirpikliuose. Jeigu naudojamas nevandeninis tirpiklis, turi būti žinomos jo toksinės savybės ir bandomosios medžiagos stabilumas šiame tirpiklyje.

4.4. Darbo eiga

4.4.1. Skaičius ir lytis. Kiekvienai medžiagos koncentracijai naudojami ne mažiau kaip aštuoni gyvūnai (keturi patinai ir keturios patelės). Jeigu bandymo metu planuojama numarinti dalį gyvūnų, jų pradinis skaičius turi būti didesnis tiek, kiek planuojama gyvūnų numarinti prieš bandymo pradžią. Gyvūnų skaičius pasibaigus bandymui turi būti tinkamas toksiškumui įvertinti. Be to, atsižvelgiant į turimą informaciją apie bandomąją medžiagą arba jos analogą, gali būti naudojama 8 gyvūnų (keturi patinai ir keturios patelės) papildoma kontrolės grupė, kuri 90 dienų gauna dideles dozes siekiant nustatyti atsako grįžtamumą arba vėlavimą po poveikio pabaigos. Stebėjimo laikotarpis pasibaigus bandymui nustatomas pagal aptiktus toksiškumo požymius.

4.4.2. Dozavimas

4.4.2.1. Iš viso naudojamos mažiausiai trys bandymo grupės ir viena kontrolinė, išimtį sudaro ribinis bandymas (4.4.3). Dozės turi būti parenkamos atsižvelgiant į turimus bandomosios ar jai giminingos medžiagos toksiškumo ir toksikokinetikos duomenis. Didžiausia dozė, kurią riboja bandomosios medžiagos fizikinės ir cheminės savybės bei biologinis poveikis, parenkama atsižvelgiant į toksinio poveikio, bet ne į žūties ar didelių kančių sukėlimo galimybę. Po to parenkama mažėjančių dozių eilė, kad būtų nustatytas atsakas į skirtingų dozių poveikį, bei dozė, nesukelianti pastebimo neigiamo poveikio (NOAEL). Dozės parenkamos taip, kad viena nuo kitos skirtųsi du keturis kartus. Kai didžiausia ir mažiausia dozė skiriasi daugiau kaip 6–10 kartų, patartina naudoti papildomą ketvirtąją bandomųjų gyvūnų grupę.

4.4.2.2. Kontrolinės grupės gyvūnai laikomi tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir bandomieji gyvūnai, išskyrus poveikį tiriamąja medžiaga. Jei tiriamajai medžiagai naudojamas tirpiklis, tai kontrolinės grupės gyvūnai turi gauti didžiausią tiriamajai grupei panaudotą tirpiklio tūrį. Kai tiriamoji medžiaga duodama šeriant ir gyvūnai mažiau suėda pašarų; tai vertinant pašarų sunaudojimą kontrolinėje grupėje atsižvelgiama į dėl pašaro sumažėjimo nepriimtinumo ar toksinio poveikio bandymo modelyje.

4.4.2.3. Būtina atkreipti dėmesį į dominančias tirpiklio savybes bei kitus lydimuosius reiškinius, pavyzdžiui, poveikis absorbcijai, pasiskirstymas, metabolizmas arba bandomosios medžiagos kaupimasis; poveikis bandomosios medžiagos cheminėms savybėms, kuris gali pakeisti jos toksines savybes; poveikis pašaro ar vandens suvartojimui arba gyvūnų mitybos būklei.

4.4.3. Ribinis bandymas. Jeigu bandymas su mažiausia 1000 mg/kg/d doze pagal aprašytą procedūrą nesukelia NOAEL ir jeigu pagal turimus duomenis apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, tai nebūtina atlikti viso bandymo su trimis dozėmis, išskyrus tuos atvejus, kai dėl numanomo poveikio žmogui reikia tirti didesnes dozes.

4.4.4. Dozių suleidimas

4.4.1. Gyvūnams bandomoji medžiaga duodama kiekvieną dieną 90 dienų; taikomas penkių dienų per savaitę dozavimas turi būti pagrįstas. Vienkartinė bandomosios medžiagos dozė suleidžiama zondu. Maksimalus vienkartinis suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo tiriamo gyvūno dydžio. Bandomosios medžiagos tirpalo tūris turi būti mažiausias. Bandomojo tūrio kitimas turi būti sumažintas taikant tokią koncentraciją, kad būtų užtikrintas pastovus kiekis naudojant visas koncentracijas. Išimtį sudaro dirginančios ir ėsdinančios medžiagos, kurių įprastos koncentracijos sukelia sunkius poveikius.

4.4.2. Kai bandomoji medžiaga patenka su pašarais arba vandeniu, svarbu užtikrinti, kad ji nekliudytų įprastinio šėrimo arba girdymo. Kai tiriamoji medžiaga pateikiama su pašarais, ji dozuojama pastovia koncentracija (ppm) arba pastovia doze, apskaičiuojama gyvūno kūno masei; gali būti taikomi alternatyvūs metodai, kurie turi būti aprašyti. Kai medžiaga suleidžiama per zondą, dozė teikiama tuo pačiu metu kiekvieną dieną, norint palaikyti pastovią medžiagos koncentraciją gyvūno masės vienetui. Kai 90 dienų bandymas atliekamas kaip įvadinis į ilgalaikį toksiškumo tyrimą, abiem atvejais taikomas vienodas šėrimas.

4.5. Stebėjimai

4.5.1. Stebėjimo laikotarpis turi būti mažiausiai 90 dienų. Papildomos grupės gyvūnai turi būti suskirstyti tolesniems stebėjimams ir turi būti laikomi tinkamą laiko tarpą be poveikio, siekiant išaiškinti toksinių požymių atsiradimą arba išnykimą.

4.5.2. Kruopšti klinikinė apžiūra turi būti atliekama mažiausiai kartą per dieną, geriausiai tuo pačiu metu, atsižvelgiant į laukiamų poveikių smailį. Gyvūnų sveikatos būklė turi būti registruojama. Mažiausiai du kartus per dieną visi gyvūnai turi būti patikrinami, nustatant žuvimą ir apnuodijimą.

4.5.3. Prieš pradedant bandymą, kartą per savaitę, atliekama visų gyvūnų kruopšti klinikinė apžiūra. Apžiūrima vienodomis sąlygomis, išėmus iš narvo, tuo pačiu laiku. Rezultatai tiksliai įrašomi į stebėjimo žurnalą, įvertinant balų sistema, naudojama bandymo laboratorijoje. Turi būti užtikrintas bandymo sąlygų pastovumas. Toksiškumo požymiai turi būti kruopščiai registruojami, nurodant atsiradimo laiką, laipsnį ir trukmę. Stebimi ir užrašomi odos, vilnos, akių, gleivinės pakitimai, akių išskyros, periferinės veiklos (pavyzdžiui, ašarojimo, plaukų pašiaušimo, vyzdžio dydžio, neįprastų kvėpavimo požymių) pakitimai. Registruojami eisenos, pozos, reakcijos į paėmimą rankomis pakitimai, kloninių ar toninių traukulių atsiradimas, elgsenos stereotipai (pavyzdžiui, besaikis valymasis, pasikartojantis sukimasis ratu) bei keista (pavyzdžiui, savęs luošinimas, vaikščiojimas atbulomis) elgsena.

4.5.4. Atliekama oftalmologinė apžiūra oftalmoskopu ar panašiu prietaisu; oftalmoskopija atliekama prieš veikiant bandomąja medžiaga ir pasibaigus bandymui. Geriausia oftalmoskopiją atlikti visiems gyvūnams, o jeigu tai neįvykdoma, tai oftalmoskopuojami gyvūnai iš grupių, kur taikomos didelės koncentracijos ir kontrolinių grupių. Jei nustato kitimus vienam gyvūnui, tai oftalmoskopija turi būti atlikta visiems gyvūnams.

4.5.5. Kūno masė ir pašarų bei vandens suvartojimas. Vieną kartą per savaitę visi gyvūnai sveriami, nustatomas pašarų suvartojimas. Jeigu bandomoji medžiaga yra duodama su geriamuoju vandeniu, vandens suvartojimas taip pat matuojamas ne rečiau kaip kartą per savaitę. Geriamojo vandens suvartojimas gali būti keičiamas bandymo tikslais.

4.5.6. Hematologija ir klinikinė biochemija

4.5.6.1. Kraujas imamas iš numatytos vietos ir laikomas nustatytomis sąlygomis. Bandymo pabaigoje kraujo mėginiai imami prieš pat gyvūnų numarinimą arba sudaro numarinimo procedūros dalį.

4.5.6.2. Hematologiniai rodikliai: hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocitų kiekis, leukocitų formulė ir bendras kiekis, trombocitų kiekis ir kraujo krešėjimo trukmė, nustatomi bandymo pradžioje, paskui kas mėnesį arba bandymo viduje ir bandymo pabaigoje.

4.5.6.3. Klinikiniai biocheminiai tyrimai atliekami vertinant pagrindinius toksinius poveikius audiniams, ypač inkstams ir kepenims, rodiklius nustato kraujo mėginiuose bandymo pradžioje, paskui kas mėnesį arba bandymo viduje ir bandymo pabaigoje. Numatoma nustatinėti elektrolitų pusiausvyrą, angliavandenių metabolizmą, kepenų ir inkstų funkciją. Specialių rodiklių nustatymas atliekamas atsižvelgiant į bandomosios medžiagos stebėjimų rezultatus. Rekomenduojama nešerti gyvūnų iš vakaro, jeigu ryte numatoma paimti kraujo bandinį. Kraujo mėginyje tirtini šie rodikliai: kalcis, fosforas, chloras, natris, kalis, bado gliukozė, alaninaminotransferazė, aspartataminotransferazė, gamaglutamiltranpeptidazė, karbamidas, albuminas, kraujo kreatininas, bendras bilirubinas ir bendras serumo baltymas.

4.5.6.4. Papildomai numatomi rodikliai, kurie gali būti audinių pažeidimo žymekliais. Rodikliai, būtini tinkamam toksiškumo poveikiui įvertinti, yra šie: lipidai, hormonai, rūgščių-šarmų pusiausvyra, methemoglbinas, cholinesterazės aktyvumas. Papildomus rodiklius atlieka, jeigu reikia tęsti nustatytų poveikių stebėjimą. Šiuos rodiklius aptaria atsižvelgiant į bandomosios medžiagos chemines savybes arba kiekvienu atskiru atveju.

4.5.6.5. Bendru atveju rodikliai parenkami atsižvelgiant į gyvūno rūšį ir stebėjimų duomenis bei bandomosios medžiagos spėjamą poveikį.

4.6. Skrodimas

4.6.1. Visi gyvūnai po bandymo skrodžiami. Registruojami kiekvieno gyvūno skrodimo metu nustatyti kūno paviršiaus, visų angų, kaukolės, krūtinės ląstos, pilvo ertmės ir jos turinio patologiniai pokyčiai. Visų gyvūnų kepenys su tulžies lataku, inkstai, antinksčiai, sėklidės ir jos prielipas, užkrūčio liauka, blužnis, smegenys bei širdis nuvalomi, kad neliktų pašalinių audinių, kuo greičiau pasveriami ir tinkamai paruošiami laikymui.

4.6.2. Organai laikomi terpėje, kuri tinka šiam organui laikyti ir nekeičia jo savybių histopatologinių tyrimų metu. Histopatologiškai tiriami: bendri pakitimai, smegenys (didieji pusrutuliai, smegenėlės ir kamienas), nugaros smegenys (visi segmentai), skrandis, plonoji ir storoji žarna (įskaitant Peyerio plokšteles), kepenys, inkstai, antinksčiai, blužnis, širdis, užkrūčio liauka, skydliaukė, trachėja ir plaučiai (įleidžiant fiksuojamosios medžiagos, o po to panardinant), lyties liaukos, gimda, prostata, šlapimo pūslė, limfiniai mazgai (vienas limfinis mazgas turi atspindėti medžiagos patekimo būdą, o kitas, esantis toliau, – sisteminius poveikius), esantis arčiau raumens periferinis nervas (sėdimasis arba blauzdikaulio) bei kaulų čiulpai (arba šviežiai paruošta kaulų čiulpų punkcija). Atsižvelgiant į gautus klinikinius ir kitus duomenis gali prireikti tirti papildomus organus. Be to, galimam tolesniam tyrimui turi būti laikomi visi organai, kurie gali būti tiriamosios medžiagos poveikio taikiniai atsižvelgiant į jos žinomas savybes.

4.6.3. Histopatologinis tyrimas

4.6.3.1. Visapusiškas histopatologinis įvertinimas atliekamas visų kontrolinės ir didžiausią dozę gavusių grupių gyvūnų organų ir audinių. Jeigu didžiausią dozę gavusių gyvūnų grupėje dėl medžiagos poveikio atsirado pakitimų, histopatologiškai ištirti privalu ir kitų grupių gyvūnus.

4.6.3.2. Privalu įvertinti visus bendruosius pažeidimus.

4.6.3.2. Privalu įvertinti papildomos grupės gyvūnų audinius ir organus, jeigu bandomosios medžiagos poveikiu kitose grupėse buvo nustatyti šių audinių ir organų pažeidimai.

II. DUOMENYS

5. Pateikiami duomenys apie kiekvieną ištirtą gyvūną. Apibendrinti gyvūnų duomenys pateikiami lentelėse, nurodant kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičių tyrimų pradžioje; gyvūnų, žuvusių bandymo metu ar humaniškai numarintų, skaičius; gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičius; kiekvieno gyvūno žūties ar numarinimo laikas; pastebėtų toksinio poveikio požymių apibūdinimas, įskaitant atsiradimo laiką, trukmę ir sunkumą; gyvūnų su pažeidimais skaičius, pažeidimų tipas ir gyvūnų su įvairių tipų pažeidimais procentas.

6. Jeigu įmanoma, skaitmeniniai rezultatai apdorojami tinkamais statistiniais metodais, kurie parenkami planuojant tyrimą.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

7. Bandymo protokolas. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:

7.1. Bandomoji medžiaga:

7.1.1. fizikinė būklė, grynumas, fizikinės ir cheminės savybės;

7.1.2. identifikacijos duomenys;

7.1.3. tirpiklis (jeigu taikytas): tirpiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.

7.2. Bandomieji gyvūnai:

7.2.1. rūšis, veislė;

7.2.2. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;

7.2.3. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir pan.;

7.2.4. kiekvieno gyvūno kūno masė bandymo pradžioje.

7.3. Bandymo sąlygos:

7.3.1. dozių parinkimo paaiškinimas;

7.3.2. detalūs duomenys apie bandomosios medžiagos receptūrą, paruošimą maišant su pašaru, preparato galinę koncentraciją, stabilumą ir homogeniškumą;

7.3.3. bandymo medžiagos suleidimo detalūs duomenys;

7.3.4. faktinės dozės (mg/kg/d), perskaičiavimo koeficientas iš pašaro-geriamojo vandens bandomosios medžiagos koncentracijos (ppm) į faktinę dozę, jeigu įmanoma;

7.3.5. pašaro ir vandens kokybė.

7.4. Rezultatai:

7.4.1. kūno masė ir kūno masės pokyčiai;

7.4.2. pašaro ir vandens suvartojimas, jeigu įmanoma;

7.4.3. duomenys apie atsaką į toksinį poveikį, įskaitant toksiškumo požymius, pagal lytį ir dozę;

7.4.4. atsakų pobūdis, sunkumo laipsnis, trukmė ir grįžtamumas;

7.4.5. oftalmoskopijos rezultatai;

7.4.6. hematologiniai tyrimai, palyginti su norma;

7.4.7. klinikiniai biocheminiai tyrimai, palyginti su norma;

7.4.8. kūno ir organų masė bei jų santykis žuvimo metu;

7.4.9. skrodimo duomenys;

7.4.10. detalus histopatologinių pokyčių aprašymas;

7.4.11. absorbcijos duomenys, jeigu yra;

7.4.12. statistinis rezultatų apdorojimas, kai tinka.

8. Duomenų aptarimas.

9. Išvados.

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B28 metodas: poūmis toksiškumas per odą. KARTOTINIŲ DOZIŲ 90 DIENŲ TOKSIŠKUMO GRAUŽIKAMS bandymas

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų patvirtinimo“ (Žin., 2004, Nr. 70-2472) patvirtintame Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas).

2. Apibrėžimai. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Pamatinės medžiagos. Nėra.

4. Bandymo metodo principas. Kelios eksperimentinių gyvūnų grupės kiekvieną dieną numatytą laiką veikiamos bandomosios medžiagos, kurios dozė laipsniškai keičiama grupėse: vienos grupės gyvūnai veikiami vienos dozės medžiagos 90 dienų. Poveikio metu gyvūnai turi būti stebimi kiekvieną dieną, kad laiku būtų registruoti toksiškumo poveikio požymiai. Gyvūnai, kurie nugaišta bandymo metu, skrodžiami, o atlikus bandymą, skrodžiami visi kiti gyvūnai, likę gyvi.

5. Kokybės kriterijai. Nėra.

6. Bandymo metodo aprašymas

6.1. Pasiruošimas. Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki bandymo. Prieš bandymą sveiki jauni gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į reikalingą skaičių grupių. Apie 24 valandas iki bandymo nuo gyvūno nugaros liemens srityje nukerpama arba nuskutama vilna, nepažeidžiant odos, kad nepasikeistų jos pralaidumas. Pakartotinai vilna nukerpama arba nuskutama apytikriai kiekvieną savaitę. Bandomosios medžiagos aplikacijai nukerpama (nuskutama) ne mažiau kaip 10 % kūno paviršiaus. Svarstant būtiną bandymui aplikacijos plotą, privalu atsižvelgti į gyvūno masę. Bandant kietas medžiagas, kurios gali būti ir užpurškiamos ant odos, bandomoji medžiaga turi būti sudrėkinta vandeniu arba tinkamu tirpikliu, kad būtų užtikrintas geras medžiagos sąlytis su oda. Naudojant tirpiklį būtina atsižvelgti į jo poveikį bandomosios medžiagos prasiskverbimui per odą. Skystos bandomosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos. Aplikaciją taiko kasdien penkias–septynias dienas per savaitę.

6.2. Bandymo sąlygos

6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai. Galima naudoti subrendusias žiurkes, triušius arba jūros kiaulytes. Kitų rūšių naudojimą būtina pagrįsti. Bandymo pradžioje kiekvienos naudojamų gyvūnų lyties kūno masės skirtumai neturi viršyti ± 20 % atitinkamos vidutinės vertės. Jei poūmis odos bandymas atliekamas kaip įvadinis prieš pagrindinį ilgalaikį bandymą, tai abiejuose bandymuose turi būti naudojami tos pačios veislės ir to paties tiekėjo gyvūnai.

6.2.2. Skaičius ir lytis. Kiekvienai medžiagos dozei naudojami ne mažiau kaip dvidešimt sveikos odos gyvūnų (dešimt patinų ir dešimt patelių). Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Jeigu bandymo metu planuojama numarinti dalį gyvūnų, jų pradinis skaičius turi būti didesnis tiek, kiek planuojama gyvūnų numarinti prieš bandymo pradžią. Be to, gali būti naudojama 20 gyvūnų (dešimt patinų ir dešimt patelių) papildoma kontrolės grupė, kuri 90 dienų gauna dideles dozes siekiant nustatyti atsako grįžtamumą arba vėlavimą po poveikio pabaigos 28 dienas pasibaigus bandymui.

6.2.3. Dozės

6.2.3.1. Dozės turi būti ne mažiau kaip trys ir kontrolinė grupė arba tirpiklio kontrolė (atsižvelgiant į tirpiklio didžiausią koncentraciją), jei naudojamas tirpiklis. Bandomosios medžiagos aplikacija turi būti atliekama apytikriai tuo pačiu laiku kiekvieną dieną. Bandomosios medžiagos kiekis turi būti reguliuojamas taip (kiekvieną savaitę arba kas dvi savaites), kad aplikuojama dozė būtų pastovi gyvūno kūno masės atžvilgiu. Kontrolinės grupės gyvūnai laikomi tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir bandomieji gyvūnai. Jei bandomajai medžiagai patekti taikomas tirpiklis, tirpiklio kontrolės grupė turi būti veikiama kaip ir bandomosios grupės gyvūnai, tik vietoje bandomosios medžiagos aplikuojamas tirpiklis tokiais tūriais, kokius gauna gyvūnai su didžiausia poveikio doze. Didžiausia dozė parenkama atsižvelgiant į toksinio poveikio, bet ne į žūties, galimybę. Mažiausia dozė neturi sukelti pastebimo žalingo poveikio. Ši koncentracija negali būti viršijama skaičiuojant mažiausią toksinio poveikio koncentraciją žmogui. Idealus atvejis, kai tarpinė koncentracija sukelia mažiausią stebimą toksišką poveikį. Jei taikoma daugiau nei viena tarpinė dozė, tai šios dozės turi sukelti laipsniškus toksinius poveikius. Grupėje, kur taikoma mažiausia ir tarpinė koncentracija, ir kontrolinėje grupėje žūties atvejų turi būti nedaug, kad būtų galima įvertinti duomenų reikšmingumą.

6.2.3.2. Jei bandomosios medžiagos aplikacija sukelia stiprų odos erzinimą, koncentracijos turi būti sumažintos, dėl ko sumažės arba išnyks toksinis poveikis: didelės dozės lygis. Jei oda buvo skaudžiai sužalota, reikia baigti bandymą ir atlikti kitą – su mažesnėmis koncentracijomis.

6.2.4. Ribinis bandymas. Jei įvadinis bandymas su 1000 mg/kg arba aukštesne doze nesukelia toksinio poveikio ir jei pagal turimus duomenis apie medžiagą nesitikima toksinio poveikio žmogui, tolesnis bandymas neatliekamas.

6.2.5. Stebėjimo laikas. Gyvūnai turi būti stebimi kiekvieną dieną viso bandymo metu (poveikis ir sveikimas). Toksiškumo požymių atsiradimas ir žūties laikas įrašomi į bandymo registracijos žurnalą.

6.2.6. Darbo eiga

6.2.6.1. Gyvūnai turi būti laikomi atskiruose narvuose. Gyvūnai veikiami bandomosios medžiagos kiekvieną dieną 7 kartus per savaitę 90 dienų laikotarpiu.

6.2.6.2. Papildomos grupės gyvūnai turi būti suskirstyti tolesniems 28 dienų stebėjimams ir turi būti laikomi be poveikio, siekiant išaiškinti toksinių požymių atsiradimą arba išnykimą. Bandomosios medžiagos aplikacijos laikas turi būti šešios valandos per dieną.

6.2.6.3. Bandomoji medžiaga turi tolygiai dengti aplikacijos plotą, ne didesnį kaip 10 % viso kūno paviršiaus. Kai medžiaga labai toksiška, dengiamas paviršius gali būti mažesnis, bet visas plotas turi būti padengtas vienodu plonu sluoksniu.

6.2.6.4. Bandomosios medžiagos poveikį užtikrina marlinis tvarstis, pritvirtintas nedirginančia lipnia juostele. Aplikacijos vieta turi būti tinkamai uždengta, kad gyvūnas negalėtų numesti marlinio tvarsčio ir praryti tiriamosios medžiagos. Galima iš dalies riboti gyvūno judesius, siekiant, kad gyvūnas neprarytų bandomosios medžiagos, bet visiška immobilizacija nepatartina.

6.2.6.5. Pasibaigus ekspozicijai, tiriamosios medžiagos likučiai nuo odos pašalinami vandeniu arba tinkamu odos valikliu.

6.2.6.6. Visi stebėjimai turi būti atliekami kiekvieną dieną ir rezultatai sistemingai įrašomi į individualias kiekvienam gyvūnui skirtas ataskaitas. Įrašai apima toksiškumo požymių atsiradimo laiką, laipsnį ir trukmę. Stebėjimas narve apima: odos ir kailio, akių ir gleivinės kitimus, kvėpavimo, kraujo, periferinės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos bei elgsenos kitimus. Vieną kartą per savaitę visi gyvūnai turi būti sveriami, nustatomas pašarų savaitinis suvartojimas. Kiekvieną dieną atliekami sistemingi stebėjimai sumažina gyvūnų praradimą dėl kanibalizmo, audinių autolizės arba pabėgimo. Pasibaigus bandymui visi gyvūnai skrodžiami. Kritę gyvūnai iš karto pašalinami iš narvų ir skrodžiami

6.2.6.7. Bandymo metu būtina:

6.2.6.7.1. atlikti oftalmologinę apžiūrą oftalmoskopu ar panašiu prietaisu; oftalmoskopija atliekama prieš veikiant bandomąja medžiaga ir pasibaigus bandymui. Geriausia oftalmoskopiją atlikti visiems gyvūnams, o jeigu tai neįvykdoma, tai oftalmoskopuojami gyvūnai iš grupių, kur taikomos didelės koncentracijos, ir kontrolinių grupių. Jei nustato kitimus vienam gyvūnui, tai oftalmoskopija turi būti atlikta visiems gyvūnams;

6.2.6.7.2. nustatyti hematologinius rodiklius: hematokritą, hemoglobino koncentraciją, eritrocitų kiekį, leukocitų formulę ir bendrą kiekį, trombocitų kiekį ir kraujo krešėjimo trukmę, protrombino laiką (nustatoma pasibaigus bandymui);

6.2.6.7.3. nustatyti klinikinius biocheminius rodiklius (pasibaigus bandymui): elektrolitų balansą, angliavandenių metabolizmą, kepenų ir inkstų funkciją. Tirtini biocheminiai rodikliai parenkami atsižvelgiant į gyvūnų rūšį ir stebėjimų duomenis bei bandomosios medžiagos spėjamą poveikį. Patartini rodikliai: kalcis, fosforas, chloras, kalis, natris, bado gliukozė (bado trukmė priklauso nuo gyvūno rūšies), serum alanin aminotransferazės, serum aspartat aminotransferazės, ornitin dekarboksilazės, gamaglutamiltranpeptidazės aktyvumas, karbamidas, bendrasis baltymas ir albuminas, kraujo kreatininas, bendras bilirubinas.

6.2.6.7.4. Kiti galimi rodikliai: lipidai, hormonai, rūgščių-šarmų balansas, methemoglbinas, cholinesterazės aktyvumas. Prireikus gali būti nustatyti ir kitokie reikalingi rodikliai.

6.2.6.7.5. atlikti šlapimo tyrimą, kuris nėra būtinas standartinių bandymų metu; jis atliekamas, kai yra indikacijos dėl numatomo ar stebimo toksiškumo;

6.2.6.7.6. priimti sprendimą dėl atliktinų rodiklių: hematologinių, klinikinės biochemijos, – prieš apsisprendimą dėl pradinės dozės tuo atveju, kai išeities duomenys nėra išsamūs.

6.2.6.8. Skrodimas. Visi gyvūnai po bandymo skrodžiami. Registruojami kiekvieno gyvūno skrodimo metu nustatyti kūno paviršiaus, visų angų, kaukolės, krūtinės ląstos, pilvo ertmės ir jos turinio patologiniai pokyčiai. Visų gyvūnų kepenys, inkstai, antinksčiai, sėklidės ir jos prielipas, užkrūčio liauka, blužnis, smegenys bei širdis nuvalomi, kad neliktų pašalinių audinių, kuo greičiau pasveriami ir tinkamai paruošiami laikymui. Organai ir audiniai laikomi terpėje, kuri tinka šiam organui arba audiniui laikyti ir nekeičia jo savybių histopatologinių tyrimų metu. Histopatologiškai tiriami: bendri pakitimai, (trachėja) ir plaučiai (įleidžiant fiksuojamąsias medžiagas, po to panardinant), smegenys (didieji pusrutuliai, smegenėlės ir kamienas), nugaros smegenys, skrandis, dvylikapirštė, akloji, gaubtinė, tiesioji, plonoji ir storoji žarnos (įskaitant Peyerio plokšteles), kepenys, inkstai, antinksčiai, blužnis, širdis, aorta, užkrūčio liauka, skydliaukė, seilių liaukos, ašarinės liaukos, (tulžies latakas), stemplė, lyties liaukos, gimda, prostata, šlapimo pūslė, limfiniai mazgai (vienas limfinis mazgas turi atspindėti medžiagos patekimo būdą, o kitas, esantis toliau, – sisteminius poveikius), (krūties liauka), esantis arčiau raumens periferinis nervas (sėdimasis arba blauzdikaulio), (akys), (kaulų čiulpai arba šviežiai paruošta kaulų čiulpų punkcija), (šlaunikaulis su sąnariniu paviršiumi). Skliaustais pažymėti audiniai turi būti histologiškai ištiriami, tik jeigu juose aptikti toksinio poveikio požymiai arba jie sudaro organo-taikinio dalį.

6.2.6.9. Histopatologinis tyrimas

6.2.6.9.1. Visapusiškas histopatologinis įvertinimas atliekamas visų kontrolinės ir didžiausią dozę gavusių grupių gyvūnų odos, organų ir audinių.

6.2.6.9.2. Privalu įvertinti visus bendruosius pažeidimus.

6.2.6.9.3. Privalu ištirti kitų dozių grupių gyvūnų organus-taikinius.

6.2.6.9.4. Jei naudojamos žiurkės, būtinai ištiriami plaučiai grupėse, kuriose taikyta maža ir tarpinė dozė, kad įvertinti infekcijos buvimą, nes tai suteikia tinkamą informaciją apie gyvūno sveikatą. Tolesni histopatologiniai tyrimai nėra būtini standartiniame bandyme, bet jie tampa privalomi, jei atsiranda organų, pakenktų didelės dozės poveikiu.

II. Duomenys

7. Apibendrinti gyvūnų duomenys pateikiami lentelėse, nurodant kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičių bandymo pradžioje; sužalotų gyvūnų skaičių; sužalojimo rūšį ir kiekvienos sužalojimo rūšies procentą. Skaitmeniniai rezultatai apdorojami tinkamais statistiniais metodais, kurie parenkami planuojant bandymą. Galima taikyti bet kokį pripažintą statistinio apdorojimo metodą.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

8. Bandymo protokolas. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:

8.1.1. rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir pan.;

8.1.2. bandymo sąlygos;

8.1.3. dozės (įskaitant tirpiklį, jei naudotas) ir koncentracijos;

8.1.4. duomenys apie atsaką į toksinį poveikį, įskaitant toksiškumo požymius, pagal lytį ir dozę;

8.1.5. nesukeliantis pastebimo poveikio lygis, jei įmanoma;

8.1.6. gyvūnų kritimo laikas bandymo metu arba gyvūnai išgyvenę iki bandymo pabaigos;

8.1.7. toksiškumo ir kitų poveikių aprašymas;

8.1.8. kiekvieno anormalinio ženklo stebėjimo laikas ir jo tolesnė plėtra;

8.1.9. duomenys apie šėrimą ir kūno masės kitimą;

8.1.10. oftalmoskopijos duomenys;

8.1.11. atlikti hematologiniai tyrimai, palyginti su norma;

8.1.12. atlikti klinikiniai biocheminiai tyrimai, palyginti su norma (įskaitant ir šlapimo tyrimus);

8.1.13. skrodimo duomenys;

8.1.14. detalus histopatologinių pokyčių aprašymas;

8.1.15. statistinis rezultatų apdorojimas, kai tinka;

8.1.16. rezultatų aptarimas;

8.1.17. rezultatų interpretacija.

8.2. Įvertinimas ir interpretacija: pagal Bendrąjį įvadą.

IV. Nuorodos

9. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade.

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B29 metodas: poūmis toksiškumas ĮKVĖPus. KARTOTINIŲ DOZIŲ 90 DIENŲ TOKSIŠKUMO GRAUŽIKAMS BANDYMAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

2. Apibrėžimai. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Pamatinės medžiagos. Nėra.

4. Bandymo metodo principas. Kelios eksperimentinių gyvūnų grupės kiekvieną dieną numatytą laiką veikiamos bandomosios medžiagos, kurios koncentracija laipsniškai keičiama grupėse:vienos grupės gyvūnai veikiami vienos koncentracijos medžiagos 90 dienų. Jei taikoma rišamoji medžiaga norimai bandomosios medžiagos koncentracijai įkvėpiamajame ore pasiekti, naudojama kontrolinė rišamosios medžiagos grupė. Poveikio metu gyvūnai stebimi kiekvieną dieną, kad laiku būtų registruoti toksiškumo poveikio požymiai. Gyvūnai, kurie nugaišta bandymo metu, skrodžiami, o atlikus bandymą, skrodžiami visi kiti gyvūnai, likę gyvi.

5. Kokybės kriterijai. Nėra.

6. Bandymo metodo aprašymas

6.1. Pasiruošimas. Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki bandymo. Prieš bandymą sveiki jauni gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į reikalingą grupių skaičių. Prireikus tinkama rišamoji medžiaga gali būti pridėta prie bandomosios medžiagos, kad užtikrintų norimą bandomosios medžiagos koncentraciją įkvėpiamajame ore. Jei dozavimui palengvinti naudojama rišamoji medžiaga arba kiti papildai, reikia tikrai žinoti, kad šios medžiagos nesukelia toksinio poveikio.

6.2. Bandymo sąlygos

6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai. Pirmenybė teikiama žiurkėms, jei nėra kontraindikacijų. Dažniausiai naudojamos sveikų jaunų suaugusių gyvūnų įprastos laboratorinės veislės. Bandymo pradžioje gyvūnų masės skirtumai neturi viršyti ± 20 % atitinkamos vidutinės vertės kiekvienai lyčiai. Jei poūmis bandymas įkvėpus atliekamas kaip įvadinis bandymas prieš pagrindinį ilgalaikį bandymą, tai abiejuose bandymuose turi būti naudojami tos pačios veislės ir to paties tiekėjo gyvūnai.

6.2.2. Skaičius ir lytis. Kiekvienai medžiagos koncentracijai naudojami ne mažiau kaip dvidešimt gyvūnų (dešimt patinų ir dešimt patelių). Jeigu bandymo metu planuojama numarinti dalį gyvūnų, jų pradinis skaičius turi būti didesnis tiek, kiek planuojama gyvūnų numarinti prieš bandymo pradžią. Be to, gali būti naudojama 20 gyvūnų (dešimt patinų ir dešimt patelių) papildoma kontrolės grupė, kuri 90 dienų gauna dideles dozes siekiant nustatyti atsako grįžtamumą arba vėlavimą po poveikio pabaigos 28 dienas pasibaigus bandymui.

6.2.3. Poveikio koncentracijos. Koncentracijų turi būti ne mažiau kaip trys ir kontrolinė grupė arba rišamosios medžiagos kontrolė (atsižvelgiant į rišamosios medžiagos didžiausią koncentraciją), jei naudojama rišamoji medžiaga. Kontrolinės grupės gyvūnai laikomi tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir bandomieji gyvūnai. Didžiausia koncentracija parenkama atsižvelgiant į toksinio poveikio, bet ne į žūties galimybę. Ši koncentracija negali būti viršijama skaičiuojant mažiausią toksinio poveikio koncentraciją žmogui. Idealus atvejis, kai tarpinė koncentracija sukelia mažiausią stebimą toksišką poveikį. Jei taikoma daugiau nei viena tarpinė koncentracija, tai šios koncentracijos turi sukelti laipsniškus toksinius poveikius. Grupėje, kur taikoma mažiausia ir tarpinė koncentracija, ir kontrolinėje grupėje žūties atvejų turi būti nedaug, kad būtų galima įvertinti duomenų reikšmingumą.

6.2.4. Poveikio laikas. Kasdienis poveikis turi būti šešios valandos po to, kai išsilygina koncentracija bandymo kameroje. Gali būti ir kitas laikas, jei siekiama specialių tikslų.

6.2.5. Įranga. Gyvūnai bandomi taikant gebančius išlaikyti dinaminį oro srautą ne mažiau kaip 12 oro pasikeitimų per valandą inhaliacinius įrenginius, kuriuose užtikrintas būtinas deguonies kiekis ir vienodai pasiskirsto poveikio oras. Jeigu naudojama kamera, jos konstrukcija turi užtikrinti, kad gyvūnai būtų nesusigrūdę, kad jie įkvėptų kaip galima daugiau bandomosios medžiagos. Paprastai, norint užtikrinti oro pastovumą kameroje, visas bandomų gyvūnų „tūris“ neturėtų viršyti 5 % bandymo kameros tūrio. Gali būti veikiamas tik snukis, tik galva arba visas kūnas; du pirmieji būdai padeda sumažinti bandomosios medžiagos patekimą kitais būdais.

6.2.5. Stebėjimo laikas. Gyvūnai stebimi kiekvieną dieną viso bandymo metu (poveikis ir sveikimas). Toksiškumo požymių atsiradimas ir žūties laikas įrašomi į bandymo registracijos žurnalą.

6.2.6. Darbo eiga

6.2.6.1. Gyvūnai veikiami bandomosios medžiagos kiekvieną dieną 5-7 kartus per savaitę 90 dienų laikotarpiu. Papildomos grupės gyvūnai suskirstyti tolesniems 28 dienų stebėjimams ir laikomi be poveikio, siekiant išaiškinti toksinių požymių atsiradimą arba išnykimą. Bandymo atlikimo temperatūra turi būti 22 °C ±3 °C, drėgmė – tarp 30 % ir 70 %, nors atskirais atvejais (aerozolių bandymas) tai netinka. Poveikio metu gyvūnai nešeriami ir negirdomi.

6.2.6.2. Bandymui turi naudoti paslankią inhaliacijos sistemą su tinkamu analitinės koncentracijos kontrolės įtaisu. Tinkamoms koncentracijoms nustatyti rekomenduojama atlikti įvadinį bandymą. Bandymo metu nustatytas toks oro srautas, kad bandymo kameroje būtų homogeninės poveikio sąlygos. Sistema turi laiduoti, kad pastovios poveikio sąlygos būtų pasiektos kuo skubiausia.

6.2.6.3. Bandymo metu būtina:

6.2.6.3.1. stebėti ir matuoti oro srauto kitimą (nuolat);

6.2.6.3.2. kvėpavimo zonoje matuoti bandomosios medžiagos tikrąją koncentraciją. Dienos poveikio laikotarpiu koncentracija negali skirtis daugiau kaip per 15 % nuo vidutinės vertės. Tačiau, bandant dulkes arba aerozolius, šis lygis negali būti pasiektas, dėl to nustato platesnį tolerancijos intervalą. Viso bandymo metu kiekvienos dienos koncentracijos turi būti pastovios (kiek įmanoma). Dalelių gamybos sistemos tobulinimu siekiama, kad dalelių dydis užtikrintų pastovią aerozolio koncentraciją. Poveikio metu nuolat tikrinamas dalelių pasiskirstymas kameroje;

6.2.6.3.3. matuoti temperatūrą ir drėgmę;

6.2.6.3.4. sistemingai stebėti gyvūnus poveikio metu ir po jo, stebėjimo rezultatus įrašinėti į individualias kiekvienam gyvūnui skirtas ataskaitas. Visi gyvūnai stebimi kasdien ir atsiradusieji toksiškumo požymiai įrašomi, žymint požymio atsiradimo pradžią, išreikštumą ir trukmę. Stebėjimas narve apima: odos ir kailio, akių ir gleivinės kitimus, kvėpavimo, kraujo, periferinės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos bei elgsenos kitimus. Vieną kartą per savaitę visi gyvūnai sveriami, nustatomas pašarų savaitinis suvartojimas. Kiekvieną dieną atliekami sistemingi stebėjimai sumažina gyvūnų praradimą dėl kanibalizmo, audinių autolizės arba pabėgimo. Pasibaigus bandymui visi gyvūnai skrodžiami. Kritę gyvūnai iš karto pašalinami iš narvų ir skrodžiami;

6.2.6.3.5. atlikti oftalmologinę kontrolę oftalmoskopu ar panašiu prietaisu; oftalmoskopija atliekama prieš veikiant bandomąja medžiaga ir pasibaigus bandymui. Geriausia oftalmoskopiją atlikti visiems gyvūnams, o jeigu tai neįvykdoma, tai oftalmoskopuojami gyvūnai iš grupių, kur taikomos didelės koncentracijos, ir kontrolinių grupių. Jei nustato kitimus vienam gyvūnui, tai oftalmoskopija turi būti atlikta visiems gyvūnams;

6.2.6.3.6. nustatyti hematologinius rodiklius: hematokritą, hemoglobino koncentraciją, eritrocitų kiekį, leukocitų formulę ir bendrą kiekį, trombocitų kiekį ir kraujo krešėjimo trukmę, protrombino laiką (nustatoma pasibaigus bandymui);

6.2.6.3.7. nustatyti klinikinius biocheminius rodiklius (pasibaigus bandymui): elektrolitų balansą, angliavandenių metabolizmą, kepenų ir inkstų funkciją. Tirtini biocheminiai rodikliai parenkami atsižvelgiant į gyvūnų rūšį ir stebėjimų duomenis bei bandomosios medžiagos spėjamą poveikį. Patartini rodikliai: kalcis, fosforas, chloras, kalis, natris, bado gliukozė (bado trukmė priklauso nuo gyvūno rūšies), serum alanin aminotransferazės, serum aspartat aminotransferazės, ornitin dekarboksilazės, gamaglutamiltranpeptidazės aktyvumas, karbamidas, bendrasis baltymas ir albuminas, kreatininas, bendras bilirubinas. Kiti galimi rodikliai: lipidai, hormonai, rūgščių-šarmų balansas, methemoglbinas, cholinesterazės aktyvumas. Prireikus gali būti nustatyti ir dar kiti reikalingi rodikliai;

6.2.6.3.8. atlikti šlapimo tyrimą, kuris nėra būtinas standartinių bandymų metu; jis atliekamas, kai yra indikacijos dėl numatomo ar stebimo toksiškumo;

6.2.6.3.9. priimti sprendimą dėl atliktinų rodiklių: hematologinių, klinikinės biochemijos, – prieš apsisprendimą dėl pradinės dozės tuo atveju, kai išeities duomenys nėra išsamūs.

6.2.6.4. Skrodimas. Visi gyvūnai po bandymo skrodžiami. Registruojami kiekvieno gyvūno skrodimo metu nustatyti kūno paviršiaus, visų angų, kaukolės, krūtinės ląstos, pilvo ertmės ir jos turinio patologiniai pokyčiai. Visų gyvūnų kepenys, inkstai, antinksčiai, sėklidės ir jos prielipas, užkrūčio liauka, blužnis, smegenys bei širdis nuvalomi, kad neliktų pašalinių audinių, kuo greičiau pasveriami ir tinkamai paruošiami laikymui. Organai ir audiniai laikomi terpėje, kuri tinka šiam organui arba audiniui laikyti ir nekeičia jo savybių histopatologinių tyrimų metu. Histopatologiškai tiriami: bendri pakitimai, trachėja ir plaučiai (įleidžiant fiksuojamąsias medžiagas, po to panardinant), nosiaryklės audiniai, smegenys (didieji pusrutuliai, smegenėlės ir kamienas), nugaros smegenys, skrandis, plonoji ir storoji žarna (įskaitant Peyerio plokšteles), kepenys, inkstai, antinksčiai, blužnis, širdis, užkrūčio liauka, skydliaukė, lyties liaukos, gimda, prostata, šlapimo pūslė, limfiniai mazgai (vienas limfinis mazgas turi atspindėti medžiagos patekimo būdą, o kitas, esantis toliau, – sisteminius poveikius), esantis arčiau raumens periferinis nervas (sėdimasis arba blauzdikaulio) bei kaulų čiulpai (arba šviežiai paruošta kaulų čiulpų punkcija). Atsižvelgiant į gautus klinikinius ir kitus duomenis gali prireikti tirti papildomus organus. Be to, galimam tolesniam tyrimui turi būti laikomi visi organai, kurie gali būti bandomosios medžiagos poveikio taikiniai atsižvelgiant į jos žinomas savybes.

6.2.6.5. Histopatologinis tyrimas

6.2.6.5.1. Visapusiškas histopatologinis įvertinimas atliekamas visų kontrolinės ir didžiausią dozę gavusių grupių gyvūnų organų ir audinių.

6.2.6.5.2. Histopatologiškai ištirti privalu ir kitų grupių gyvūnus, jeigu didžiausią dozę gavusių gyvūnų grupėje dėl medžiagos poveikio atsirado pakitimų.

6.2.6.5.3. Privalu įvertinti visus bendruosius pažeidimus.

6.2.6.5.4. Privalu ištirti histopatologiškai papildomos grupės gyvūnų pažeistus audinius ir organus.

6.2.6.5.5. Gyvūnų, gavusių mažas arba tarpines dozes, plaučiai taip pat turi būti ištirti histopatologiškai. Tai gali suteikti tinkamą informaciją dėl gyvūno sveikatos. Tolesni histopatologiniai tyrimai nėra būtini standartiniame bandyme, bet jie tampa privalomi, jei atsiranda organų, pakenktų didelės dozės poveikiu.

6.2.6.5.6. Kai naudojama papildoma grupė, histopatologiniai tyrimai turi būti atlikti su audiniai ir organais, kuriuose buvo nustatyti poveikio požymiai.

II. Duomenys

7. Apibendrinti gyvūnų duomenys pateikiami lentelėse, nurodant kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičių bandymo pradžioje; gyvūnų, žuvusių bandymo metu ar humaniškai numarintų, skaičius; gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičius; kiekvieno gyvūno žūties ar numarinimo laikas; pastebėtų toksinio poveikio požymių apibūdinimas, įskaitant atsiradimo laiką, trukmę ir sunkumą; gyvūnų su pažeidimais skaičius, pažeidimų tipas ir gyvūnų su įvairių tipų pažeidimais procentas. Skaitmeniniai rezultatai apdorojami tinkamais statistiniais metodais, kurie parenkami planuojant bandymą. Galima taikyti bet kokį pripažintą statistinio apdorojimo metodą.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

8. Bandymo protokolas. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:

8.1. Bandomieji gyvūnai:

8.1.1. rūšis, veislė;

8.1.2. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;

8.1.3. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir pan.

8.2. Bandymo sąlygos: poveikio sistemos aprašymas su smulkiomis techninėmis charakteristikomis; gyvūnų laikymo bandymo kameroje aprašymas; temperatūros, drėgmės, koncentracijos matuoklių aprašymas su techninėmis charakteristikomis.

8. 3. Poveikio duomenys: lentelės su vidutinėmis vertėmis ir standartiniu nuokrypiu:

8.3.1. oro srauto greitis per inhaliacijos prietaisą;

8.3.2. oro temperatūra ir drėgmė;

8.3.3. vardinės koncentracijos (bendras bandomosios medžiagos kiekis, įdėtas į inhaliacijos prietaisą, padalytas iš oro tūrio);

8.3.4. tirpiklio (jei naudotas) rūšis;

8.3.5. tikrosios koncentracijos kvėpavimo zonoje bandymo metu;

8.3.6. vidutinis dalelių dydis;

8.3.7. duomenys apie atsaką į toksinį poveikį, įskaitant toksiškumo požymius, pagal lytį ir dozę;

8.3.8. nesukeliantis pastebimo poveikio lygis, jei įmanoma;

8.3.9. gyvūnų kritimo laikas bandymo metu arba gyvūnai, išgyvenę iki bandymo pabaigos;

8.3.10. toksiškumo ir kitų poveikių aprašymas;

8.3.11. kiekvieno anormalinio ženklo stebėjimo laikas ir jo tolesnė plėtra;

8.3.12. duomenys apie šėrimą ir kūno masės kitimą;

8.3.13. oftalmoskopijos duomenys;

8.3.14. atlikti hematologiniai tyrimai, palyginti su norma;

8.3.15. atlikti klinikiniai biocheminiai tyrimai, palyginti su norma (įskaitant ir šlapimo tyrimus);

8.3.16. skrodimo duomenys;

8.3.17. detalus histopatologinių pokyčių aprašymas;

8.3.18. statistinis rezultatų apdorojimas, kai tinka;

8.3.19. rezultatų aptarimas;

8.3.20. rezultatų interpretacija.

8.4. Įvertinimas ir interpretacija. Šio metodo rezultatų įvertinimas ir interpretacija pateikti Bendrajame įvade.

IV. Nuorodos

9. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade.

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B30 METODAS: Lėtinio TOKSIŠKUMO bandymas

I. bendrosios nuostatos

2. Apibrėžimai. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Pamatinės medžiagos. Nėra.

4. Bandymo metodo principas. Bandomoji medžiaga duodama septynis kartus per savaitę keletui eksperimentinių gyvūnų grupių, vieną dozę duodant vienai grupei didžiąją gyvūnų gyvenimo dalį. Veikimo bandomąja medžiaga laikotarpiui ir jam pasibaigus eksperimentiniai gyvūnai stebimi kasdien, siekiant nustatyti toksiškumo požymius.

5. Kokybės kriterijai. Nėra.

6. Bandymo metodo aprašymas

6.1. Pasiruošimas. Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki bandymo. Prieš bandymą sveiki jauni gyvuliukai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes.

6.2. Bandymo sąlygos

6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai

6.2.1.1. Remiantis anksčiau atliktų bandymų duomenimis gali būti naudojamos įvairios gyvūnų (graužikai arba negraužikai) rūšys. Pirmenybė teikiama žiurkėms. Naudojami įprastinių laboratorinių kamienų gyvūnų sveiki jaunikliai ir medžiagos davimas doze prasideda iškart po atjunkymo.

6.2.1.2. Bandymo pradžioje kūno masės variacijos ribos turi siekti ± 20% kūno masės vidurkio. Jei prieš ilgalaikį bandymą yra atliekamas pusiau chroninis oralinis bandymas, tai abiejų bandymų metu naudojami tos pačios rūšies ar kamieno gyvūnai.

6.2.2. Gyvūnų skaičius ir lytis

6.2.2.1. Duodant medžiagą skirtinga doze graužikams ir kartu naudojant kontrolinę grupę, naudojama mažiausiai 40 gyvūnų (20 patelių ir 20 patinėlių). Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Jei numarinimai numatomi iš anksto, tai bandomųjų gyvūnų skaičius padidinamas padidinant gyvūnų, kuriuos numatoma numarinti prieš užbaigiant bandymą, skaičių.

6.2.2.2. Negraužikų atveju priimtina, kad būtų naudojamas mažesnis gyvūnų skaičius, tačiau kiekvienoje grupėje turi būti mažiausiai po 4 kiekvienos lyties gyvūnus.

6.2.3. Dozė ir veikimo dažnumas

6.2.3.1. Naudojamos mažiausiai 3 bandomosios dozės naudojant kontrolinę gyvūnų grupę. Didžiausia dozė, sukelianti aiškiai pasireiškiantį toksiškumą, nesukeliant perteklinio mirtingumo. Mažiausia dozė, nesukelianti akivaizdaus toksiškumo.

6.2.3.2. Tarpinė dozė išdėstyta tarp aukščiausios ir žemiausios dozių.

6.2.3.3. Pasirenkant dozes reikėtų remtis anksčiau atliktų toksiškumo bandymų duomenimis.

6.2.3.4. Veikimas dozėmis atliekamas kasdien. Jei cheminė medžiaga duodama, sumaišius ją su vandeniu ar pašaru, ji turi būti lengvai prieinama.

6.2.4. Kontrolė

6.2.4.1. Kartu naudojama kontrolinė grupė, identiška grupėms, kurios veikiamos bet kuriuo aspektu, išskyrus veikimą bandomąja medžiaga.

6.2.4.2. Atskirais atvejais, tokiais kaip įkvėpimo bandymai, naudojant aerozolius arba oraliniai bandymai, naudojant nežinomo biologinio aktyvumo emulsiklius, naudojama ir neigiama kontrolinė grupė. Neigiama kontrolinė grupė veikiama tuo pačiu būdu kaip ir bandomosios grupės, išskyrus tai, kad gyvūnai neveikiami jokia bandomąja medžiaga, nei prietaisu.

6.2.5. Davimo būdas

6.2.5.1. Duodama dviem būdais – per burną ir kvėpuojamąjį traktą. Davimo būdo pasirinkimas priklauso nuo bandomosios medžiagos fizikinių ir cheminių ypatybių ir panašaus veikimo būdo žmonių tarpe.

6.2.5.2. Duodant per odą susiduriama su didelėmis praktinio pobūdžio problemomis. Chroninis sisteminis toksiškumas, atsirandantis dėl poodinės absorbcijos, įprastiniu atveju lemia kito oralinio testo metu gaunamus duomenis ir gaunama daug informacijos apie poodinės absorbcijos, įvertintos, anksčiau atlikus poodinio toksiškumo testus, perteklių.

6.3. Oraliniai tyrimai

6.3.1. Jei bandomoji medžiaga absorbuojama iš virškinamojo trakto ir jei šis įsisavinimo būdas yra vienas iš būdų, kuriuo žmonės susiduria su bandomąja medžiaga, tai pasirenkamas davimo per burną būdas, nebent nustatomos kontraindikacijos.

6.3.2. Gyvūnai gali gauti bandomąją medžiagą su maistu, ištirpintu vandenyje arba su kapsule.

6.3.3. Dozavimas atliekamas septynis kartus per savaitę kasdien, dozuojant penkis kartus per savaitę gali paskatinti atsistatymą bei pašalinti toksiškumą tuo metu, kai nėra dozuojama ir tai turi įtakos gaunamiems duomenims bei vėliau atliekamam jų įvertinimui. Tačiau pirmiausia remiantis praktiniu patyrimu, rekomenduojama vykdyti dozavimą penkis kartus per savaitę.

6.4. Įkvėpimo bandymai

6.4.1. Dėl to, kad įkvėpimo bandymuose susiduriama su didesnėmis techninėmis problemomis, nei duodant bandomąją medžiagą kitais būdais, čia pateikiamas detalus vadovas, nurodantis, kaip duoti medžiagą šiuo būdu. Ypatingų situacijų atveju lašinimas į trachėją yra alternatyvus problemos sprendimo būdas.

6.4.2. Atliekant ilgalaikius veikimus doze, remiamasi veikimu žmonių atžvilgiu, veikiant gyvūnus kasdien šešias valandas po to, kai suvienodinamos koncentracijos kameros viduje, penkiskart per savaitę (protarpinis veikimas) arba, atsižvelgiant į galimą aplinkos veikimą, veikiama 22–24 valandas per dieną septynis kartus per savaitę (pastovus veikimas), vieną valandą per dieną šeriant kameroje laikomus gyvūnus tuo pačiu metu. Abiem atvejais gyvūnai pastoviai veikiami nustatytomis bandomosios medžiagos koncentracijomis. Pagrindinis protarpinio ir pastoviojo veikimų skirtumas yra tai, kad protarpinis veikimas užtrunka 17–18 valandų, per kurias gyvūnai atsigauna po efektų, atsiradusių dėl kasdieninio veikimo, o tai užtrunka žymiai ilgiau savaitgaliais.

6.4.3. Protarpinio ar pastoviojo veikimo pasirinkimas priklauso nuo bandymo tikslų bei nuo žmogaus veikimo, kuris imituojamas. Tačiau reikia apsvarstyti ir konkrečius techninius sunkumus. Pavyzdžiui, pastoviojo veikimo teikiamų privalumų, imituojant aplinkos sąlygas, reikia atsisakyti, nes veikimo metu gyvūnus reikia šerti ir girdyti ir dėl to, kad reikia sukurti žymiai sudėtingesnį (bei labiau patikimesnį) aerozolį ir garus, bei imtis priežiūros.

6.5. Veikimo kamera.

6.5.1. Gyvūnai tiriami įkvėpimo bandymui skirta įranga, kuri sukurta, kad palaikytų pastovų dinaminį oro srautą, vykstant mažiausiai 12 oro pasikeitimų per valandą, tam kad užtikrinti tinkamą deguonies koncentraciją anksčiau pasiskirsčiusioje atmosferoje, kuria veikiama. Kontrolinė kamera bei ta, kurioje atliekamas veikimas, turi būti identiškos pagal konstrukciją ir modelį, kad veikimo sąlygos visais aspektais būtų užtikrintos, išskyrus veikimą bandomąja medžiaga. Nežymus neigiamas slėgis kameros viduje bendru atveju palaikomas, kad būtų išvengta bandomosios medžiagos patekimo į supančią aplinką. Kameros turi sumažinti bandomųjų gyvūnų susigrūdimą. Kad būtų užtikrintas kameros atmosferos stabilumas, tūris, kurį užima tiriamieji gyvūnai, neturi viršyti 5% bandymui naudojamos kameros tūrio.

6.5.2. Matavimai ir priežiūra:

6.5.2.1. oro srautas: oro srauto, patenkančio per kamerą, greitis pastoviai prižiūrimas.

6.5.2.2. Koncentracija: kasdieninio veikimo metu bandomosios medžiagos koncentracija neturi peržengti ±15% vidutinės vertės.

6.5.2.3. Temperatūra ir drėgmė: graužikų atveju temperatūra palaikoma apie 22±2°C ir drėgmė kameroje turi siekti nuo 30% iki 70%, išskyrus tą atvejį, kai naudojamas vanduo tam, kad bandomoji medžiaga virstų suspensija kameros atmosferoje. Pastoviai stebima temperatūra bei drėgmė.

6.5.2.4. Dalelių dydžio matavimai: nustatomi kameros atmosferoje esančių dalelių, įskaitant skysčius ar kietuosius aerozolius, dydžiai. Aerozolių dalelės turi būti tokio dydžio, kad naudojamas tiriamasis gyvūnas galėtų jas įkvėpti. Kameros atmosferos mėginiai įnešami į gyvūnų kvėpuojamąją zoną. Oro mėginys, remiantis gravimetrine analize, turi atspindėti dalelių, kuriomis gyvūnai veikiami, pasiskirstymą ir visus aerozolius, esančius suspensijoje, netgi jei didžioji aerozolio dalis nėra įkvepiama. Dalelių dydis nustatomas kaip galima dažniau, kuriant sistemą tam, kad užtikrintų aerozolio stabilumą ir po to kuo dažniau veikimų metu tam, kad būtų galima tinkamai nustatyti dalelių, kuriomis gyvūnai veikiami, pasiskirstymą.

7. Bandymo trukmė. Dozių davimas trunka mažiausiai dvylika mėnesių.

7.1. Darbo eiga

7.1.1. Stebėjimas

7.1.1.1. Detalus klinikinis tyrimas atliekamas vienąkart per dieną. Kasdien atliekami papildomi stebėjimai ir imamasi atitinkamų veiksmų norint sumažinti gyvūnų gaišimą bandymo metu, pavyzdžiui, skrosti ar užšaldyti tuos gyvūnus, kurie buvo rasti nugaišę, ir izoliuoti ar numarinti silpnus bei mirštančius gyvūnus. Nustatomas toksinių efektų pasireiškimo laikas bei eiga, taip pat sumažinamas gyvūnų gaišimas dėl ligos, autolizės ar kanibalizmo.

7.1.1.2. Registruojami visų gyvūnų klinikiniai požymiai, įskaitant regos bei neurologinius pokyčius, taip pat mirtingumas, toksinių sąlygų, įskaitant ir įtariamus auglius, pasireiškimo laikas bei eiga.

7.1.1.3. Per pirmąsias trylika bandymo savaites kartą per savaitę reikėtų registruoti visų gyvūnų kūno masę ir po to vienąkart per savaitę kas mėnesį. Per pirmąsias trylika bandymo savaites kas savaitę reikėtų įvertinti pašaro įsisavinimą ir vėliau kas trys mėnesiai, nekreipiant dėmesio į tai, sveikatos būklė ar svoris verčia elgtis kitaip.

7.1.2. Hematologinis tyrimas

7.1.2.1. Praėjus trims, šešiems mėnesiams, o po to kas pusę metų surinkus kraujo mėginius iš gyvūnų, atliekamas hematologinis tyrimas (nustatant hemoglobino kiekį, eritrocitų užimamą tūrį kraujyje, absoliutų eritrocitų, leukocitų ir trombocitų skaičių arba kitus rodiklius kraujo krešėjimo aktyvumui įvertinti). Jei įmanoma, tai kraujo mėginiai imami iš tų pačių žiurkių tokiu pačiu laiko intervalu. Be to, iš negraužikų reikėtų paimti išankstinius mėginius tyrimui.

7.1.2.2. Jei, remiantis klinikiniais stebėjimais, spėjama, kad bandymo metu sutriko gyvūnų sveikata, tai paveiktų gyvūnų kraujo analizė atliekama kitaip.

7.1.2.3. Gyvūnų, kuriems buvo duota didžiausia medžiagos dozė, bei kontrolinės grupės individų kraujo mėginių analizė atliekama kitu būdu. Kitos grupės (ar grupių), kuriai (-ioms) buvo duota mažesnė dozė, kraujo analizė atliekama kitaip, jei tarp didžiausią dozę gavusios ir kontrolinės grupės egzistuoja pagrindinis skirtumas arba tai buvo nustatyta patologinių tyrimų metu.

7.1.3. Šlapimo analizė. Šlapimo mėginiai, paimti iš visų gyvūnų, mėginiai, paimti iš kiekvieno gyvūno, arba mėginių rinkinys, paimtas iš vienos lyties graužikų grupės, tiriamas šitaip:

7.1.3.1. išorė: individualaus gyvūno šlapimo tūris bei tankumas;

7.1.3.2. baltymų, gliukozės, ketonų, paslėpto kraujo kiekis (pusiau kiekybiškai);

7.1.3.3. nuosėdų mikroskopinis vaizdas (pusiau kiekybiškai).

7.2. Klinikinė chemija

7.2.1. Kas šešis mėnesius ir tyrimo pabaigoje iš visų negraužikų bei 10 abiejų lyčių žiurkių, priklausančių visoms grupėms, jei įmanoma, iš tų pačių žiurkių esant tam pačiam laiko tarpui, surenkami kraujo mėginiai, kad vėliau būtų ištirti klinikinės chemijos aspektu. Be to, iš visų negraužikų paimami išankstiniai mėginiai. Paėmus mėginius, paruošiama plazma ir atliekami tokie matavimai:

7.2.1.1. absoliuti baltymo koncentracija;

7.2.1.2. albumino koncentracija;

7.2.1.3. kepenų funkciniai testai (tokie kaip šarminės fosfatazės aktyvumo nustatymo testas, glutamino piruvato transaminazės aktyvumo nustatymo testas ir glutamato oksalacetato transaminazės aktyvumo nustatymo testas), g glutamiltranspeptidazė, ornitino dekarboksilazė;

7.2.1.4. angliavandenių metabolizmas, įvertinant gliukozės kraujyje trūkumą;

7.2.1.5. inkstų funkciniai testai, tokie kaip šlapalo nustatymas kraujyje.

7.3. Pagrindinis skrodimas

7.3.1. Atliekamas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, įskaitant tuos, kurie nugaišo eksperimentų metu arba buvo numarinti tada, kai buvo nustatyta, jog jie miršta. Prieš numarinimą paimami visų gyvūnų kraujo mėginiai, kad būtų atlikta diferencinė kraujo analizė. Visi akivaizdžiai matomi sutrikimai, augliai ar sutrikimai, kurie, kaip įtariama, gali būti augliai, užkonservuojami, stengiantis rasti sąsajas tarp pagrindinių stebėjimų ir mikroskopinių analizių.

7.3.2. Histopatologiniams tyrimams išsaugomi visi audiniai ir organai, tokie kaip: smegenys - (pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūviai, smegenėlių ir smegenų žievė, hipofizė, tiroidinė liauka (įskaitant paratiroidinę liauką), užkrūčio liaukos audinys, plaučiai (trachėja), širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys, blužnis, inkstai, antinksčiai, stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, gimda, šlapimo pūslė, limfmazgiai, kasa, lytinės liaukos, pagalbiniai lytiniai organai, moterų pieno liauka, oda, raumenynas, periferinis nervas, stuburo smegenys (sprando, krūtinės ląstos ir juosmens), krūtinkaulis su kaulų čiulpais, šlaunikaulis, (įskaitant ir segmentinį paviršių) ir akys. Plaučių ir šlapimo pūslės pripildymas fiksuojančiąja medžiaga yra optimalus būdas išsaugoti šiuos audinius; plaučių pripildymas įkvėpimo tyrimuose yra svarbus atitinkamų histopatologinių tyrimų aspektu. Ypatingų tyrimų, tokių kaip toksiškumo įkvėpus bandymai, atveju tiriamas visas kvėpuojamasis traktas, įskaitant nosies ertmę, gerklas ir ryklę.

7.3.3. Jei atliekami kiti klinikiniai tyrimai, tai šių procedūrų metu gauta informacija turi būti prieinama, atliekant mikroskopinę analizę, nes ta informacija yra pagrindinė patologo darbo gairė.

7.4. Histopatologinis tyrimas

7.4.1. Visi akivaizdūs pokyčiai, ypač bet kurio organo augliai ir kiti sutrikimai, tiriami mikroskopiškai:

7.4.1.1. visų užkonservuotų organų ir audinių mikroskopinę analizę, visapusiškai apibūdinant sutrikimus, rastus:

7.4.1.1.1. visuose gyvūnuose, kurie nugaišo arba buvo numarinti tyrimo metu;

7.4.1.1.2. visose tiriamosios grupės, kuriai buvo duota didelė medžiagos dozė, bei

kontrolinės grupės gyvūnuose.

7.4.2. Organai arba audiniai, kurių anomalijas sukėlė arba galėjo sukelti bandomoji medžiaga, taipogi tiriami grupės, gavusios mažą dozę, gyvūnuose.

7.4.3. Jei tyrimo metu gautas rezultatas įrodo, kad gyvūnų gyvenimo normali trukmė ypač sutrumpėjo arba atsirado efektai, galintys turėti įtakos toksiniam atsakui, tai kita dozė tiriama taip, kaip aprašyta aukščiau.

7.4.4. Informacija apie sutrikimų, pasitaikančių tiriamųjų gyvūnų kamiene, dažnumas laboratorinėmis sąlygomis (pvz., remiantis anksčiau atliktų tyrimų duomenimis) yra būtina teisingai įvertinant pokyčių gyvūnuose, paveiktuose tiriamąja medžiaga, reikšmę.

II. DUOMENYS

8. Duomenys pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti pažeidimai, skaičius, pažeidimų tipai bei gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pažeidimai, skaičius, išreikštas procentais.

9. Duomenis reikėtų vertinti atitinkamu statistiniu metodu. Galima naudoti bet kokį statistinį metodą, vartojamą visuotinu mastu.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

10. Bandymo protokolas. Bandymo protokole, jei įmanoma, pateikiama tokia informacija:

10.1. rūšis, veislė, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras;

10.2. bandymo sąlygos:

10.2.1. aparato, kuris naudojamas veikimui medžiaga, aprašymas: įskaitant konstrukciją, tipą, išmatavimus, oro šaltinį, dalelių ir aerozolių sukūrimo sistemą, vėdinimo metodą, veikimą iškvėptu oru ir gyvūnų laikymo kameroje, kai ji naudojama, metodą. Reikėtų aprašyti matuojamą temperatūrą, drėgmę ir, jei reikia, tai aerozolių koncentracijų arba dalelių dydžio stabilumą;

10.2.2. veikimo metu gauti duomenys: duomenys pateikiami lentelėse, nurodant vidurkius ir variacijos dydį (pvz., standartinį nukrypimą) ir pateikiant:

10.2.2.1. oro srauto, pereinančio per įkvėpimo įrangą, greitį;

10.2.2.2. oro temperatūrą ir drėgmę;

10.2.2.3. nominalias koncentracijas (absoliutus tiriamosios medžiagos kiekis, įneštas į įkvėpimo įrangą padalytas iš oro tūrio);

10.2.2.4. prietaiso, jei jis naudojamas, pobūdį;

10.2.2.5. tikrąsias koncentracijas, esančias tiriamoje kvėpuojamoje zonoje;

10.2.2.6. vidutinius dalelių dydžius (jei įmanoma tai nurodyti).

10.3. Duomenys apie toksinį atsaką pagal tirtą lytį ir duotą dozę.

10.4. Jei įmanoma, duomenų lygis, kuriam esant jokių efektų nebuvo pastebėta.

10.5. Mirties laikas arba tyrimo metu arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo.

10.6. Toksinių ir kitų efektų apibūdinimas.

10.7. Kiekvieno nenormalaus požymio ir, iš jo išplaukiančių pasekmių, pastebėjimo momentas.

10.8. Duomenys apie pašarą bei kūno masę.

10.9. Oftalmologinių stebėjimų duomenys.

10.10. Naudoti hematologiniai tyrimai ir jų metu gauti rezultatai.

10.11. Naudoti klinikinės biochemijos tyrimai ir jų metu gauti visi (įskaitant bet kurios šlapimo analizės) duomenys.

10.12. Skrodimo metu gauti duomenys.

10.13. Visų histopatologinių tyrimų metu gautų duomenų detalus apibūdinimas.

10.14. Duomenų statistinė analizė, jei įmanoma tai padaryti.

10.15. Duomenų aptarimas.

10.16. Duomenų aiškinimas.

11. Įvertinimas ir aiškinimas. Šio metodo duomenų įvertinimas ir aiškinimas pateiktas Bendrajame įvade.

IV. NUORODOS

12. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade.

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B31 METODAS: TERATOGENIŠKUMAS GRAUŽIKAMS IR NE GRAUŽIKAMS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

2. Apibrėžimai. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Pamatinės medžiagos. Nėra.

4. Bandymo metodo principas. Bandomoji medžiaga duodama laipsniškomis dozėmis arba koncentracijomis keleto eksperimentinių grupių gyvūnų nėščioms patelėms nėštumo metu, kai vyksta organogenezė, vieną dozę duodant vienos grupės gyvūnams. Prieš pat numatomą atsivedimą patelės numarinamos, išimama gimda ir tiriamas jos turinys. Bandymo metu įvertinamas embriono dangalų ir gemalo toksiškumas.

5. Kokybės kriterijai. Nėra.

6. Bandymo metodo aprašymas

6.1. Pasiruošimas

6.1.1. Likus 5 dienoms iki bandymo, sveikos, jaunos, subrendusios ir neapvaisintos panašaus amžiaus ir dydžio gyvūnų patelės aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis ir po to suporuojamos su žinomo vislumo patinais. Apvaisintos patelės „aklos atrankos“ metodu atrenkamos į grupes, kurios paveikiamos bandomąja medžiaga.

6.1.2. Naudojamas natūralus suporuojant arba dirbtinis apvaisinimas. Bandomoji medžiaga duodama patelėms kiekvieną dieną iškart po implantavimo ir visu organogenezės periodu. Likus vienai dienai iki bandymo pabaigos, histerektomijos būdu išimami gemalai ir tiriamos jų vidurių bei skeleto anomalijos, įskaitant sulėtėjusį augimą, sulėtėjusį sukaulėjimą ar plonųjų žarnų hemoragijas.

6.2. Bandymo sąlygos

6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai. Naudojamos žiurkės, pelės, žiurkėnai ir triušiai. Dažniausiai naudojamos žiurkės ir triušiai. Naudojami įprastiniai laboratoriniai kamienai. Kamienas neturi pasižymėti mažu vaisingumu ir turi būti žinomas jo atsakas į teratogenus. Gyvūnai laikomi atskirai narveliuose.

6.2.2. Skaičius ir lytis. Duodant bandomąją medžiagą skirtinga doze, naudoti 20 apvaisintų patelių (žiurkių, pelių bei žiurkėnų) arba 12 apvaisintų triušių patelių, kad užtikrinti pakankamą vadų ir jose esančių jauniklių skaičių bei įvertinti bandomosios medžiagos teratogeninį aktyvumą.

6.2.3. Dozė. Naudojamos mažiausiai 3 bandomosios bei kontrolinė dozės. Jeigu bandomoji medžiaga duodama, panaudojant tirpiklį, tai kontrolinei grupei medžiaga irgi duodama, naudojant šį tirpiklį. Jeigu naudojamas tirpiklis, tai žinomos jo toksikologinės savybės, jis nėra teratogeniškas bei neturi įtakos vislumui. Išskyrus veikimą bandomąja medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai laikomi tokiomis pat sąlygomis kaip ir bandomosios grupės individai. Nepaisant ribotumo, susijusio su bandomosios medžiagos fizikochemine prigimtimi ar biologinėmis savybėmis, didžiausia jos dozė turi sukelti aiškiai išreikštą toksiškumą, pasireiškiantį nedideliu kūno masės sumažėjimu, tačiau ne daugiau kaip 10 % patelių kritimu. Mažiausia duota bandomosios medžiagos dozė neturi sukelti jokių akivaizdžių toksiškumo požymių. Tarpinė dozė turi būti tarp didelės ir mažos dozių.

6.2.4. Kontrolė. Kai medžiagos pasižymi nedideliu toksiškumu, ir jei dozė mažesnė 1000 mg/kūno masei, nepasireiškia embriotoksiškumas ar teratogeniškumas, tai bandymai, naudojant kitas medžiagos dozes, nėra reikalingi.

6.2.5. Ekspozicijos trukmė. Nulinė tyrimo diena yra ta, kurios metu stebimos makšties išskyros ir (arba) sperma (jei įmanoma). Dozė duodama pagrindinės organogenezės metu. Tai atliekama 6–15 dieną naudojant peles ir žiurkes, 6–14 dieną naudojant žiurkėnus arba 6-18 dieną naudojant triušius. Jei nulinę dieną atliekamas suporavimas arba dirbtinis apsėklinimas, tai laikas pratęsiamas vieną dieną. Dozė papildomai duodama dar vieną dieną, likusią iki numatomo medžiagos patekimo laiko.

6.2.6. Stebėjimas. Kiekvieną dieną vieną kartą atliekamas išsamus klinikinis tyrimas. Atliekami papildomi stebėjimai ir imamasi atitinkamų priemonių, kad bandomųjų gyvūnų kritimas sumažėtų.

6.3. Procedūra

6.3.1. Bandomoji medžiaga duodama per burną, su kapsule kiekvieną dieną ir tuo pačiu metu.

6.3.2. Bandomųjų gyvūnų patelės veikiamos bandomąja medžiaga kiekvieną dieną visu veikimo periodu. Dozė parenkama, remiantis patelių kūno mase prieš duodant medžiagą arba pagal greitą svorio priaugimą nėštumo metu. Gyvūnai periodiškai sveriami ir dozė parenkama, remiantis pačiais naujausiais duomenimis apie kūno masę. Toksiškumo požymiai registruojami, vos tik jie pastebimi, įskaitant pasireiškimo laiką, laipsnį ir trukmę. Patelės, kurios prieš subrendimą pasisavino medžiagą arba kurioms įvyko abortas, numarinamos ir tiriamos makroskopiškai. Pasibaigus veikimui, stebėjimo periodas trunka tol, kol liks viena diena iki nustatyto laiko; tai daroma tam, kad būtų atliekamas stebėjimas visą nėštumo periodą bei būtų išvengta klaidingo rezultatų aiškinimo, atsirandančio dėl po to sekančio natūralaus gimimo. Stebint gyvūnus narveliuose neapsiribojama odos ir kailio pakitimais, akių ir gleivinių membranų, o taipogi kvėpavimo, apytakos, autonominės bei centrinės nervų sistemų, somatomotorinio aktyvumo ir elgsenos stebėjimais. Kiekvieną savaitę atliekami maisto įsisavinimo matavimai. Gyvūnai sveriami kiekvieną savaitę.

6.3.3. Skrodimas. Kritimo atveju arba tyrimo pabaigoje patelės ištiriamos makroskopiškai, siekiant rasti bet kokias struktūrines anomalijas arba patologinius pokyčius, kurie galėjo atsirasti nėštumo metu. Iškart po kritimo išimama gimda ir tiriamas jos turinys, siekiant nustatyti embriono arba gemalo žūtį bei gyvų embrionų skaičių. Paprastai įmanoma nustatyti žūties laiką gimdoje, jei šitai įvyko. Žiurkių bei triušių atveju nustatomas corpora lutea skaičius. Nustatoma gemalų lytis ir jie atskirai pasveriami, užrašomos masės ir apskaičiuojama vidutinė gemalo masė. Po pašalinimo kiekvienas gemalas apžiūrimas iš išorės. Žiurkių, pelių ir žiurkėnų atveju 1/3–1/2 kiekvienos vados dalies ištiriamos skeleto anomalijos, likusi kiekvienos vados dalis paruošiama ir, panaudojant atitinkamus metodus, ištiriamos minkštojo audinio anomalijos. Naudojant triušius, kruopščiai ištiriamos kiekvieno gemalo vidurių bei skeleto anomalijos.

II. DUOMENYS

7. Duomenys pateikiami apibendrintai, naudojant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, apvaisintų gyvūnų skaičius, gyvų gemalų skaičius bei gemalų, turinčių minkštojo ar skeleto anomalijas, skaičius bei jų sąsajos su konkrečia vada. Duomenys vertinami atitinkamu statistiniu metodu. Naudojamas bet koks visuotinai pripažintas statistinis metodas.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

8. Bandymo protokolas. Bandymo protokole, jei įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:

8.1. rūšis, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras;

8.2. bandymo sąlygos;

8.3. dozės lygiai (įskaitant įrangą, jei ši buvo panaudota) ir koncentracijos;

8.4. duomenys apie toksinį atsaką pagal duotą dozę;

8.5. jei įmanoma, tai dozės lygis, kuriam esant jokių efektų nebuvo pastebėta;

8.6. kritimo laikas arba tyrimo metu arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo;

8.7. toksinių ir kitų efektų apibūdinimas;

8.8. kiekvieno nenormalaus požymio stebėjimo laikas;

8.9. duomenys apie pašarą bei kūno masę;

8.10. nėštumo trukmė ir duomenys apie vadą (įskaitant ankstesnius duomenis);

8.11. duomenys apie gemalus (gyvas ar žuvęs, lytis, minkštojo audinio ir skeleto defektai);

8.12. duomenys apie vadą (gyvi ar kritę jaunikliai, jų lytis, kiekvienos vados gyvūnų minkštųjų audinių ir skeleto defektai);

8.13. duomenų statistinė analizė, jei įmanoma tai padaryti;

8.14. duomenų aptarimas;

8.15. duomenų aiškinimas.

9. Įvertinimas ir aiškinimas. Šio metodo duomenų įvertinimas ir aiškinimas pateiktas Bendrajame įvade.

IV. NUORODOS

10. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade.

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B32 METODAS: KAncerogeniŠKUMO BANDYMAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

2. Apibrėžimai. Šio metodo apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Pamatinės medžiagos. Nėra.

4. Bandymo metodo principas. Kelios eksperimentinių gyvūnų grupės kiekvieną dieną septynis kartus per savaitę veikiamos bandomosios medžiagos. Poveikio metu ir jam pasibaigus gyvūnai stebimi kiekvieną dieną, kad laiku registruoti toksiškumo poveikio požymius, ypač auglio formavimąsi.

5. Kokybės kriterijai. Nėra.

6. Bandymo metodo aprašymas. Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki bandymo. Prieš bandymą sveiki gyvūnų jaunikliai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į bandomąją bei kontrolinę grupes.

6.1. Eksperimentiniai gyvūnai

6.1.1. Remiantis anksčiau atliktų bandymų rezultatais, gali būti naudojamos kitos (graužikų arba negraužikų) rūšys. Naudojami įprastinių laboratorinių kamienų sveiki gyvūnų jaunikliai; medžiagos dozavimas prasideda iškart po atjunkymo.

6.1.2. Bandymo pradžioje kiekvieno gyvūno kūno masės skirtumai neturi viršyti ± 20 % atitinkamos vidutinės vertės. Jei pusiau lėtinis bandymas per virškinimo traktą atliekamas kaip įvadinis prieš pagrindinį ilgalaikį bandymą, tai abiejuose bandymuose naudojami tos pačios veislės ir to paties tiekėjo gyvūnai.

6.2. Skaičius ir lytis. Graužikams kiekvienai medžiagos dozei naudojama ne mažiau kaip 100 gyvūnų (50 patinų ir 50 patelių), kartu naudojant kontrolinę grupę. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Jeigu bandymo metu planuojama numarinti dalį gyvūnų, jų pradinis skaičius turi būti didesnis tiek, kiek planuojama gyvūnų numarinti prieš bandymo pradžią.

6.3. Dozė

6.3.1. Naudojamos 3 bandomosios dozės bei kontrolinė grupė. Didžiausia dozė turi sukelti minimalų toksiškumą, pasireiškiantį nežymiu kūno masės prieaugio sumažėjimu (mažesniu nei 10 %), nepakeičiant įprastinės gyvenimo trukmės dėl poveikių, kurie skiriasi nuo auglių atsiradimo.

6.3.2. Mažiausia dozė neturi paveikti gyvūno normalaus augimo, vystymosi bei gyvenimo trukmės ar sukelti toksiškumo požymius. Ši dozė neturi būti mažesnė nei didžiausios dozės dešimtoji dalis (10 %).

6.3.3. Tarpinė dozė turi būti tarp didžiausios ir mažiausios dozių.

6.3.4. Pasirenkant dozes būtina remtis anksčiau atliktų toksiškumo bandymų duomenimis.

6.3.5. Kiekvieną dieną veikiama bandomąja medžiaga. Jei cheminė medžiaga duodama sumaišius ją su vandeniu ar pašaru, ji turi būti pastoviai prieinama.

6.4. Kontrolė

6.4.1. Kartu naudojama kontrolinė grupė, tapati veikiamoms grupėms pagal visas savybes, išskyrus veikimą bandomąja medžiaga.

6.4.2. Išskirtiniais atvejais, kaip aerozolio bandymai įkvėpus arba nežinomo biologinio aktyvumo emulsiklio taikymo per virškinimo traktą bandymai, naudojama papildoma kontrolinė grupė, kuri neveikiama tirpiklio.

6.5. Suleidimo būdas. Suleidžiama trimis pagrindiniais būdais: per virškinimo traktą, per odą ir įkvėpus. Suleidimo būdo pasirinkimas priklauso nuo bandomosios medžiagos fizikinių ir cheminių savybių ir poveikio žmogui panašumo.

6.6. Bandymas per virškinimo traktą

6.6.1. Jei bandomoji medžiaga absorbuojama iš virškinimo trakto ir jei šis įsisavinimo būdas yra vienas iš būdų, kuriuo žmonės susiduria su bandomąja medžiaga, tai pasirenkamas suleidimas per virškinimo traktą, nebent nustatomos kontraindikacijos. Gyvūnai gauna bandomąją medžiagą šeriant, ištirpintą vandenyje arba kapsulėje.

6.6.2. Dozavimas atliekamas septynis kartus per savaitę kasdien, nes dozavimas penkis kartus per savaitę gali paskatinti atsistatymą bei pašalinti toksiškumą tuo metu, kai nėra dozuojama ir tai turi įtakos gaunamiems duomenims bei vėliau atliekamam jų įvertinimui. Tačiau jei nagrinėti iš praktinės pusės, tai dozavimas penkias dienas per savaitę yra priimtinas.

6.7. Bandymas per odą. Poveikis per odą, sutepant ją, parenkamas tada, kai spėjama, kad tai yra galimas poveikio būdas žmogui ir yra modelis, kaip inicijuojami odos pakenkimai. 6.8. Bandymas įkvėpus

6.8.1. Bandymuose įkvėpus susiduriama su didesnėmis techninėmis problemomis, nei suleidžiant bandomąją medžiagą kitais būdais, čia pateikiamas detalus vadovas, nurodantis, kaip suleisti medžiagą šiuo būdu. Ypatingais atvejais lašinimas į trachėją yra alternatyvus problemos sprendimo būdas.

6.8.2. Ilgalaikiai bandymai atliekami atsižvelgiant į medžiagos galimą poveikį žmogui. Gyvūnai gauna dienos šešių valandų dozę, kai susivienodina bandomosios medžiagos koncentracija bandymo kameros viduje, penkiskart per savaitę (nutrūkstamas poveikis) arba, atsižvelgiant į galimą aplinkos poveikį, veikiama 22–24 valandas per dieną septynis kartus per savaitę (pastovus poveikis), vieną valandą per dieną šeriant laikomus gyvūnus tuo pačiu metu ir tvarkant kameras. Abiem atvejais gyvūnai veikiami pastoviomis bandomosios medžiagos koncentracijomis.

6.8.3. Pagrindinis nutrūkstamo ir pastovaus poveikių skirtumas yra tas, kad taikant nutrūkstamą poveikį, susidaro 17–18 valandų, o savaitgaliais ženkliai ilgiau, per kurias gyvūnai atsigauna nuo požymių, atsiradusių dėl kasdieninio veikimo.

6.8.4. Nutrūkstamas ar pastovus poveikis pasirenkamas atsižvelgiant į bandymo tikslą ir į poveikio žmogui mechanizmą, kuris imituojamas. Tačiau būtina atsižvelgti į konkrečius techninius sunkumus, pavyzdžiui: pastoviojo poveikio privalumų, imituojant aplinkos sąlygas, atsvara yra tai, kad poveikio metu gyvūnus reikia šerti ir girdyti, be to būtina ženkliai sudėtingesnė konstrukcija, užtikrinanti aerozolio ir garų generavimą bei stebėsenos įranga.

6.9. Poveikio kamera

6.9.1. Gyvūnai bandomi taikant gebančius išlaikyti dinaminį oro srautą ne mažiau kaip 12 oro pasikeitimų per valandą inhaliacinius įrenginius, kuriuose užtikrintas būtinas deguonies kiekis ir vienodai pasiskirsto poveikio oras. Jeigu naudojama kamera, jos konstrukcija turi užtikrinti, kad gyvūnai būtų nesusigrūdę, kad jie įkvėptų kaip galima daugiau bandomosios medžiagos. Paprastai, norint užtikrinti oro pastovumą kameroje, visas bandomų gyvūnų „tūris“ neturėtų viršyti 5 % bandymo kameros tūrio. Kontrolinė kamera įrengta visiškai taip kaip bandomoji. Neženklus neigiamas slėgis kameros viduje palaikomas, kad išvengti bandomosios medžiagos patekimo į supančią aplinką.

6.9.2. Bandymo metu būtina:

6.9.2.1. stebėti ir matuoti oro srauto kitimą (nuolat);

6.9.2.2. kvėpavimo zonoje matuoti bandomosios medžiagos tikrąją koncentraciją. Dienos poveikio laikotarpiu koncentracija negali skirtis daugiau kaip per 15 % nuo vidutinės vertės. Viso bandymo metu kiekvienos dienos koncentracijos pastovios (kiek įmanoma);

6.9.2.3. stebėti temperatūrą ir drėgmę: graužikų atveju temperatūra turi būti apie 22 °C ± 2 °C ir drėgmė kameroje – nuo 30 % iki 70 %, išskyrus, kai naudojamas vanduo, kad bandomoji medžiaga virstų suspensija kameros atmosferoje. Geriau nuolat stebėti temperatūrą bei drėgmę;

6.9.2.4. matuoti dalelių dydį: nustatyti kameros ore esančių dalelių, įskaitant skysčius ar kietuosius aerozolius, dydžius. Aerozolių dalelės tokio dydžio, kad naudojamas bandomasis gyvūnas jas įkvėptų. Kameros oro mėginiai paimami iš gyvūnų kvėpuojamosios zonos. Oro mėginys turi atstovauti dalelių sklaidą gyvūno kvėpavimo zonoje ir apskaičiuojamas gravimetrinės analizės metodu visoms aerozolio dalelėms, net toms, kurios nėra įkvėpiamos. Dalelių gamybos sistemos tobulinimu siekiama, kad dalelių dydis užtikrintų pastovią aerozolio koncentraciją. Poveikio metu nuolat tikrinama dalelių sklaida kameroje.

6.10. Bandymo trukmė. Kancerogeniškumo bandymas trunka didžiąją bandomųjų gyvūnų gyvenimo dalį. Pelių ir žiurkėnų atveju, bandymas baigiamas po 18 mėnesių, o žiurkių atveju – po vienerių metų; tačiau, tam tikrų kamienų gyvūnams, kurių gyvenimo trukmė yra ilgesnė ir (arba) lėtas savaiminis auglio atsiradimas, bandymas turi trukti vienerius metus pelėms ir žiurkėnams ir 30 mėnesių žiurkėms. Kita pratęsto bandymo priežastis yra, kai kontrolinės bei mažiausios dozės grupių gyvūnų skaičius siekia 25 %. Jei bandymo metu nustatytas skirtingas dozės atsakas atsižvelgiant į gyvūnų lytį, tai kiekviena lytis vertinama atskirai. Jei dėl akivaizdžių toksiškumo požymių nugaišta didelę dozę gavusi grupė, tai nėra būtina baigti bandymą, kai pasireiškusios toksinės reakcijos nesukelia kritimo kitose bandymo grupėse. Neigiamas bandymo rezultatas priimtinas, kai ne daugiau kaip 10 % bet kurios grupės gyvūnų nugaišta bandymo metu dėl autolizės, kanibalizmo ar laikymo sąlygų ir po 18 mėnesių išlieka ne mažiau kaip 50 % visų grupių pelių ir žiurkėnų, bei po vienerių metų – ne mažiau kaip 50 % visų grupių žiurkių.

7. Darbo eiga

7.1. Stebėjimas

7.1.1. Kasdienis stebėjimas narve apima: odos ir kailio, akių ir gleivinės kitimus, kvėpavimo, kraujo, periferinės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos bei elgsenos kitimus.

7.1.2. Reguliariai atliekami gyvūnų stebėjimai užtikrina, kad gyvūnai nekristų bandymo metu dėl kanibalizmo, audinių autolizės bei vietos pakeitimo. Kritę gyvūnai pašalinami bei skrodžiami.

7.1.3. Registruojami visų gyvūnų klinikiniai požymiai bei žuvimas. Ypatingas dėmesys skiriamas auglio augimui: registruojamas kiekvieno akivaizdžiai matomo bei užčiuopiamo auglio atsiradimo laikas, vieta, dydis ir išorė.

7.1.4. Pirmąsias 13 tyrimo savaičių kas savaitę matuojamas pašaro (ir vandens, jei bandomoji medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu) įsisavinimas; vėliau tai atliekama kas trys mėnesiai, nebent sveikatos būklė ar kūno masės kitimai verčia elgtis kitaip.

7.1.5. Pirmąsias 13 tyrimo savaičių kas savaitę sveriamas kiekvienas gyvūnas ir individualiai užrašoma jo kūno masė, vėliau tai atliekama vieną kartą per mėnesį.

7.2. Klinikiniai tyrimai

7.2.1. Hematologinis tyrimas

7.2.1.1. Jei, atsižvelgiant į laikomų narveliuose gyvūnų stebėjimus, spėjama, kad bandymo metu sutriko gyvūnų sveikata, tai atliekama paveiktų bandomąja medžiaga gyvūnų diferencinė kraujo analizė.

7.2.1.2. Praėjus vieneriems metams ar 18 mėnesių, iš gyvūnų paimami kraujo tepinėliai. Kraujo diferencinė analizė atliekama gavusiems didžiausią medžiagos dozę gyvūnams bei kontrolinės grupės gyvūnams. Jei šie duomenys, ypač duomenys gauti prieš numarinimą, arba patologinių tyrimų duomenys rodo, kad reikia ištirti kraują, tai diferencinė kraujo analizė atliekama grupei, gavusiai žemesnę dozę.

7.3. Skrodimas

7.3.1. Atliekamas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, įskaitant tuos kurie krito bandymų metu arba buvo numarinti tada, kai buvo nustatyta, jog jie krenta. Visi akivaizdžiai matomi augliai, pakitę audiniai arba organai, kurie įtariami kaip augliai, turi būti užkonservuoti.

7.3.2. Histopatologiniams tyrimams išsaugomi, laikant atitinkamoje terpėje, tokie audiniai ir organai: smegenys - (pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūviai, smegenėlių ir smegenų žievė), hipofizė, tiroidinė liauka (įskaitant paratiroidinę liauką), užkrūčio liaukos audinys, plaučiai (trachėja), širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys, blužnis, inkstai, antinksčiai, stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, gaubiančioji žarna, gimda, šlapimo pūslė, limfmazgiai, kasa, lytinės liaukos, pagalbiniai lytiniai organai, pieno liauka, oda, raumenynas, periferinis nervas, stuburo smegenys (sprando, krūtinės ląstos ir juosmens), krūtinkaulis su kaulų čiulpais, šlaunikaulis (įskaitant ir segmentinį paviršių) ir akys.

7.3.3. Plaučių ir šlapimo pūslės pripildymas fiksuojančiąja medžiaga yra optimalus būdas išsaugoti šiuos audinius; plaučių pripildymas įkvėpimo bandymuose svarbus atitinkamiems histopatologiniams tyrimams atlikti. Įkvėpimo bandymo atveju išsaugomi visi kvėpavimo organai, įskaitant nosies ertmę, gerklas ir ryklę.

7.4. Histopatologinis tyrimas

7.4.1 Visapusiškas histopatologinis įvertinimas atliekamas visų kontrolinės ir didžiausią dozę gavusių grupių gyvūnų odos, organų ir audinių.

7.4.2. Visi akivaizdžiai matomi augliai, pakitę audiniai arba organai, kurie įtariami kaip augliai, mikroskopiškai ištiriami visose grupėse.

7.4.3. Jei gavusios didelę dozę ir kontrolinė grupės skiriasi pagal neoplastinių sutrikimų pasireiškimą, tai ištiriami konkretūs šių grupių organai ar audiniai.

7.4.4. Jei nustatyti ženklūs neoplastinių pakitimų skirtumai grupėje, gavusioje didelę dozę, ir kontrolinėje grupėje, tai būtinas histopatologinis ištyrimas kitų dozes gavusių grupių tų audinių arba organų, kur buvo nustatyti kitimų skirtumai.

7.4.5. Jei didelę dozę gavusioje grupėje gyvūnų išlikimas yra ženkliai mažesnis negu kontrolinėje, tai detaliai ištiriama kita, mažesnę dozę gavusi, grupė.

7.4.6. Jei yra įrodymas, kad toksiniai ar kiti poveikiai turėjo įtakos neoplastiniam atsakui grupėje, gavusioje didelę dozę, tai detaliai ištiriama kita, mažesnę dozę gavusi, grupė.

II. DUOMENYS

8. Duomenys pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti augliai bandymo metu, skaičius, auglių nustatymo laikas bei gyvūnų, kuriuose buvo nustatyti augliai numarinimo metu, skaičius. Skaitmeniniai rezultatai apdorojami tinkamais statistiniais metodais, kurie parenkami planuojant bandymą. Galima taikyti bet kokį pripažintą statistinio apdorojimo metodą.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

9. Bandymo protokolas. Bandymo protokole turi būti pateikiama tokia informacija:

9.1. rūšis, veislė, kamienas, gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir pan.;

9.2. bandymo sąlygos: poveikio sistemos aprašymas su smulkiomis techninėmis charakteristikomis; gyvūnų laikymo bandymo kameroje aprašymas; temperatūros, drėgmės, koncentracijos matuoklių aprašymas su techninėmis charakteristikomis;

9.3. veikimo metu gauti duomenys: pateikiami lentelėse, nurodant vidutines vertes ir variacijos matą (pavyzdžiui, standartinį nukrypimą) ir pateikiant:

9.3.1. oro srauto greičius per inhaliacijos prietaisą;

9.3.2. oro temperatūrą ir drėgmę;

9.3.3. vardines koncentracijas (bendras bandomosios medžiagos kiekis, įdėtas į inhaliacijos prietaisą, padalytas iš oro tūrio);

9.3.4. tirpiklio (jei naudotas) rūšis;

9.3.5. tikrąsias koncentracijas kvėpavimo zonoje bandymo metu;

9.3.6. vidutinius dalelių dydžius (jei įmanoma tai nurodyti);

9.3.7. dozes (įskaitant tirpiklį, jei taikytas) ir koncentracijas.

9.4. duomenys apie atsaką į toksinį poveikį, įskaitant toksiškumo požymius, pagal lytį ir dozę;

9.5. gyvūnų kritimo laikas bandymo metu arba gyvūnai, išgyvenę iki bandymo pabaigos;

9.6. toksiškumo požymiai atsižvelgiant į lytį ir dozę;

9.7. toksiškumo ir kitų poveikių aprašymas;

9.8. kiekvieno anormalinio požymio stebėjimo laikas ir jo tolesnis plėtimasis;

9.9. duomenys apie šėrimą ir kūno masės kitimą;

9.10. atlikti hematologiniai tyrimai, palyginti su norma;

9.11. skrodimo duomenys;

9.12. detalus histopatologinių pokyčių aprašymas;

9.13. statistinis rezultatų apdorojimas (kai tinka);

9.14. duomenų aptarimas;

9.15. duomenų interpretavimas.

10. Įvertinimas ir interpretacija pagal Bendrąjį įvadą.

IV. NUORODOS

11. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade.

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B33 METODAS: LĖTINIO TOKSIŠKUMO IR KAncerogeniŠKUMO JUNGTINIS TYRIMAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

2. Apibrėžimai. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Pamatinės medžiagos. Nėra.

4. Bandymo metodo principas

4.1. Jungtinio lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo badymo tikslas yra nustatyti medžiagos, kuria žinduoliai veikiami ilgiau nei įprasta, lėtinį ir kancerogeninį poveikius.

4.2. Kancerogeniškumo bandymo metu naudojama mažiausiai viena papildoma bandomąja medžiaga veikiama grupė bei papildoma kontrolinė grupė. Dozė, suleidžiama papildomai didelės dozės grupei, gali būti didesnė, nei ta, kuri suleidžiama grupei kancerogeniškumo bandymo metu. Kancerogeniškumo bandymo metu įvertinamas bendras toksinis poveikis bei atsakas į kancerogeną. Papildomos bandomosios medžiagos veikiamos grupės gyvūnams įvertinamas bendras toksinis poveikis.

4.3. Kelios eksperimentinių gyvūnų grupės kiekvieną dieną septynis kartus per savaitę veikiamos bandomosios medžiagos: vienai grupei – vieną dozę, tai trunka didesnę gyvūnų gyvenimo laikotarpį. Poveikio metu ir jam pasibaigus gyvūnai turi būti stebimi kiekvieną dieną, norint laiku registruoti toksiškumo poveikio požymius, ypač auglio formavimąsi.

5. Kokybės kriterijai. Nėra.

6.1. Eksperimentiniai gyvūnai

6.1.1. Dažniausiai naudojama rūšis yra žiurkės. Remiantis anksčiau atliktų bandymų rezultatais, gali būti naudojamos kitos (graužikų arba negraužikų) rūšys. Naudojami įprastinių laboratorinių kamienų sveiki gyvūnų jaunikliai; medžiagos dozavimas prasideda iškart po atjunkymo.

6.1.2. Bandymo pradžioje kiekvieno gyvūno kūno masės skirtumai neturi viršyti ± 20 % atitinkamos vidutinės vertės. Jei pusiau lėtinis bandymas per virškinimo traktą atliekamas kaip įvadinis prieš pagrindinį ilgalaikį bandymą, tai abiejuose bandymuose turi būti naudojami tos pačios veislės ir to paties tiekėjo gyvūnai.

6.2. Skaičius ir lytis

6.2.1 Skaičius ir lytis. Graužikams kiekvienai medžiagos dozei naudojama ne mažiau kaip 100 gyvūnų (50 patinų ir 50 patelių), kartu naudojant kontrolinę grupę. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Jeigu bandymo metu planuojama numarinti dalį gyvūnų, jų pradinis skaičius turi būti didesnis tiek, kiek planuojama gyvūnų numarinti prieš bandymo pradžią.

6.2.2. Papildomoje veikiamojoje grupėje, skirtoje įvertinti ne navikinės kilmės patologinius kitimus, turi būti po 20 kiekvienos lyties gyvūnų, o papildomoje kontrolinėje grupėje turi būti po 10 kiekvienos lyties gyvūnų.

6.3. Dozė

6.3.1. Kancerogeniškumui įvertinti naudojamos 3 bandomosios dozės bei kontrolinė grupė. Didžiausia dozė turi sukelti minimalų toksiškumą, pasireiškiantį nežymiu kūno masės prieaugio sumažėjimu (mažesniu nei 10 %), nepakeičiant įprastinės gyvenimo trukmės dėl poveikių, kurie skiriasi nuo auglių atsiradimo.

6.3.3. Tarpinė dozė turi būti tarp didžiausios ir mažiausios dozių.

6.3.4. Pasirenkant dozes būtina remtis anksčiau atliktų toksiškumo bandymų duomenimis.

6.3.5. Atliekant lėtinio toksiškumo bandymą, naudojamos papildomos, veikiamos bandomąja medžiaga, bei kontrolinės grupės. Didžiausia veikiamoji dozė papildomai grupei turi sukelti apibrėžtus toksiškumo požymius.

6.3.6. Kiekvieną dieną veikiama bandomąja medžiaga. Jei cheminė medžiaga duodama sumaišius ją su vandeniu ar pašaru, ji turi būti nuolat prieinama.

6.4. Kontrolė

6.4.1. Kartu naudojama kontrolinė grupė, ta pati veikiamoms grupėms pagal visas savybes, išskyrus veikimą bandomąja medžiaga.

6.4.2. išskirtiniais atvejais, kaip aerozolio bandymai įkvėpus arba nežinomo biologinio aktyvumo emulsiklio taikymo per virškinimo traktą bandymai, naudojama papildoma kontrolinė grupė, kuri neveikiama tirpiklio.

6.5.1. Bandymas per virškinimo traktą. Jei bandomoji medžiaga absorbuojama iš virškinimo trakto ir jei šis įsisavinimo būdas yra vienas iš būdų, kuriuo žmonės susiduria su bandomąja medžiaga, tai pasirenkamas suleidimas per virškinimo traktą, nebent nustatomos kontraindikacijos. Gyvūnai gauna bandomąją medžiagą šeriant, ištirpintą vandenyje arba kapsulėje. Dozavimas atliekamas septynis kartus per savaitę kasdien, nes dozavimas penkis kartus per savaitę gali paskatinti atsistatymą bei pašalinti toksiškumą tuo metu, kai nėra dozuojama ir tai turi įtakos gaunamiems duomenims bei vėliau atliekamam jų įvertinimui. Tačiau, jei nagrinėtume iš praktinės pusės, tai dozavimas penkias dienas per savaitę yra priimtinas.

6.5.2. Bandymas per odą. Poveikis per odą, sutepant ją, parenkamas tada, kai spėjama, kad tai yra galimas poveikio būdas žmogui ir yra modelis, kaip inicijuojami odos pakenkimai. 6.5.3. Bandymas įkvėpus

6.5.3.1. Bandymuose įkvėpus susiduriama su didesnėmis techninėmis problemomis, nei suleidžiant bandomąją medžiagą kitais būdais, čia pateikiamas detalus vadovas, nurodantis, kaip suleisti medžiagą šiuo būdu. Ypatingais atvejais lašinimas į trachėją yra alternatyvus problemos sprendimo būdas.

6.5.3.2 Ilgalaikiai bandymai atliekami atsižvelgiant į medžiagos galimą poveikį žmogui. Gyvūnai gauna dienos šešių valandų dozę, kai susivienodina bandomosios medžiagos koncentracija bandymo kameros viduje, penkiskart per savaitę (nutrūkstamas poveikis) arba atsižvelgiant į galimą aplinkos poveikį veikiama 22–24 valandas per dieną septynis kartus per savaitę (pastovus poveikis), vieną valandą per dieną šeriant laikomus gyvūnus tuo pačiu metu ir tvarkant kameras. Abiem atvejais gyvūnai veikiami pastoviomis bandomosios medžiagos koncentracijomis. Pagrindinis nutrūkstamo ir pastovaus poveikių skirtumas yra tas, kad taikant nutrūkstamą poveikį, susidaro 17–18 valandų, o savaitgaliais ženkliai ilgiau, per kurias gyvūnai atsigauna nuo požymių, atsiradusių dėl kasdieninio veikimo.

6.5.3.3. Nutrūkstamas ar pastovus poveikis pasirenkamas atsižvelgiant į bandymo tikslą ir į poveikio žmogui mechanizmą, kuris imituojamas. Tačiau būtina atsižvelgti į konkrečius techninius sunkumus, pavyzdžiui: pastovaus poveikio privalumų, imituojant aplinkos sąlygas, atsvara yra tai, kad poveikio metu gyvūnus reikia šerti ir girdyti, be to, būtina ženkliai sudėtingesnė konstrukcija, užtikrinanti aerozolio ir garų generavimą bei stebėsenos įranga.

6.6. Poveikio kamera.

6.6.1. Gyvūnai bandomi taikant gebančius išlaikyti dinaminį oro srautą ne mažiau kaip 12 oro pasikeitimų per valandą inhaliacinius įrenginius, kuriuose užtikrintas būtinas deguonies kiekis ir vienodai pasiskirsto poveikio oras. Jeigu naudojama kamera, jos konstrukcija turi užtikrinti, kad gyvūnai būtų nesusigrūdę, kad jie įkvėptų kaip galima daugiau bandomosios medžiagos. Paprastai, norint užtikrinti oro pastovumą kameroje, visas bandomų gyvūnų „tūris“ neturėtų viršyti 5 %. bandymo kameros tūrio. Kontrolinė kamera įrengta visiškai taip kaip bandomoji. Neženklus neigiamas slėgis kameros viduje palaikomas, kad būtų išvengta bandomosios medžiagos patekimo į supančią aplinką.

6.6.2. Bandymo metu būtina:

6.6.2.1. stebėti ir matuoti oro srauto kitimą (nuolat);

6.6.2.2. kvėpavimo zonoje matuoti bandomosios medžiagos tikrąją koncentraciją. Dienos poveikio laikotarpiu koncentracija negali skirtis daugiau kaip per 15 % nuo vidutinės vertės. Viso bandymo metu kiekvienos dienos koncentracijos pastovios (kiek įmanoma);

6.6.2.3. stebėti temperatūrą ir drėgmę: graužikų atveju temperatūra apie 22 °C ± 2 °C ir drėgmė kameroje – nuo 30 % iki 70 %, išskyrus, kai naudojamas vanduo, kad bandomoji medžiaga virstų suspensija kameros atmosferoje. Geriau nuolat stebėti temperatūrą bei drėgmę;

6.6.2.4. matuoti dalelių dydį: nustatyti kameros ore esančių dalelių, įskaitant skysčius ar kietuosius aerozolius, dydžius. Aerozolių dalelės tokio dydžio, kad naudojamas bandomasis gyvūnas jas įkvėptų. Kameros oro mėginiai paimami iš gyvūnų kvėpuojamosios zonos. Oro mėginys turi atstovauti dalelių sklaidą gyvūno kvėpavimo zonoje ir apskaičiuojamas gravimetrinės analizės metodu visoms aerozolio dalelėms, net toms, kurios nėra įkvėpiamos. Dalelių gamybos sistemos tobulinimu siekiama, kad dalelių dydis užtikrintų pastovią aerozolio koncentraciją. Poveikio metu nuolat tikrinama dalelių sklaida kameroje.

6.7. Bandymo trukmė

6.7.1. Kancerogeniškumo bandymas trunka didžiąją bandomųjų gyvūnų gyvenimo dalį. Pelių ir žiurkėnų atveju bandymas baigiamas po 18 mėnesių, o žiurkių atveju – po vienerių metų; tačiau tam tikrų kamienų gyvūnams, kurių gyvenimo trukmė yra ilgesnė ir (arba) lėtas savaiminis auglio atsiradimas, bandymas turi trukti vienerius metus pelėms ir žiurkėnams ir 30 mėnesių žiurkėms. Kita pratęsto bandymo priežastis yra, kai kontrolinės bei mažiausios dozės grupių gyvūnų skaičius siekia 25 %. Jei bandymo metu nustatytas skirtingas dozės atsakas atsižvelgiant į gyvūnų lytį, tai kiekviena lytis vertinama atskirai. Jei dėl akivaizdžių toksiškumo požymių nugaišta didelę dozę gavusi grupė, tai nėra būtina baigti bandymą, kai pasireiškusios toksinės reakcijos nesukelia kritimo kitose bandymo grupėse. Neigiamas bandymo rezultatas priimtinas, kai ne daugiau kaip 10 % bet kurios grupės gyvūnų nugaišta bandymo metu dėl autolizės, kanibalizmo ar laikymo sąlygų ir po 18 mėnesių išlieka ne mažiau kaip 50 % visų grupių pelių ir žiurkėnų, bei po vienerių metų – ne mažiau kaip 50 % visų grupių žiurkių.

6.7.2. Atliekant lėtinio toksiškumo bandymą, mažiausiai metus naudojamos papildomos grupės, veikiamos bandomąja medžiaga ir sudarytos iš 20 kiekvienos lyties gyvūnų, bei kontrolinės grupės, sudarytos iš 10 kiekvienos lyties gyvūnų. Numatomas gyvūnų numarinimas, kad būtų galima tirti bandomosios medžiagos sukeltus patologinius procesus, kuriems neturi įtakos gyvūnų senėjimas.

7. Darbo eiga

7.1. Stebėjimas

7.1.1. Kasdienis stebėjimas narve apima: odos ir kailio, akių ir gleivinės kitimus, kvėpavimo, kraujo, periferinės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos bei elgsenos kitimus.

7.1.2. Atitinkamais laiko tarpais atliekamas papildomų bandomųjų grupių gyvūnų klinikinis apžiūrėjimas.

7.1.3. Reguliariai atliekami gyvūnų stebėjimai užtikrina, kad gyvūnai nekristų bandymo metu dėl kanibalizmo, audinių autolizės bei vietos pakeitimo. Kritę gyvūnai pašalinami bei skrodžiami.

7.1.4. Registruojami visų gyvūnų klinikiniai požymiai, įskaitant nervų sistemos bei akių pokyčius, bei žuvimas. Ypatingas dėmesys skiriamas auglio augimui: registruojamas kiekvieno akivaizdžiai matomo bei užčiuopiamo auglio atsiradimo laikas, vieta, dydis ir išorė. Fiksuojamas kiekvieno toksiškumo požymio atsiradimo bei plėtimosi laikas.

7.1.5. Pirmąsias 13 tyrimo savaičių kas savaitę matuojamas pašaro (ir vandens, jei bandomoji medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu) įsisavinimas; vėliau tai atliekama kas trys mėnesiai, nebent sveikatos būklė ar kūno masės kitimai verčia elgtis kitaip.

7.1.6. Pirmąsias 13 tyrimo savaičių kas savaitę sveriamas kiekvienas gyvūnas ir individualiai užrašoma jo kūno masė, vėliau tai atliekama vieną kartą per mėnesį.

8. Klinikiniai tyrimai

8.1. Hematologinis tyrimas

8.1.1. Praėjus trims, šešiems mėnesiams, o po to kas pusę metų, surinkus kraujo mėginius iš kiekvienos grupės dešimties kiekvienos lyties žiurkių, atlikti hematologinį tyrimą (nustatant hemoglobino kiekį, eritrocitų užimamą tūrį kraujyje, bendrą eritrocitų, leukocitų ir trombocitų skaičių, kitus rodiklius kraujo krešėjimo aktyvumui įvertinti). Jei įmanoma, tai kraujo mėginiai imami iš tų pačių žiurkių tokiu pačiu laiko tarpu.

8.1.2. Jei, atsižvelgiant į laikomų narveliuose gyvūnų stebėjimus, spėjama, kad bandymo metu sutriko gyvūnų sveikata, tai atliekama paveiktų bandomąja medžiaga gyvūnų diferencinė kraujo analizė.

8.1.3. Kraujo diferencinė analizė atliekama gavusiems didžiausią medžiagos dozę gyvūnams bei kontrolinės grupės gyvūnams. Jei šie duomenys, ypač duomenys, gauti prieš numarinimą, arba patologinių tyrimų duomenys rodo, kad reikia ištirti kraują, tai diferencinė kraujo analizė atliekama grupei, gavusiai žemesnę dozę.

8.2. Šlapimo analizė

8.2.1. Surinkti šlapimo mėginius iš kiekvienoje grupėje esančių dešimties kiekvienos lyties žiurkių, jei įmanoma, surenkama iš tų pačių žiurkių tais pačiais laiko tarpais, kai buvo atliekami hematologiniai tyrimai.

8.2.2. Atlikti kiekvieno gyvūno arba bendro visų gyvūnų mėginio, arba vienos lyties gyvūnų, esančių vienoje graužikų grupėje, tokius tyrimus:

8.2.1.1. bendras vaizdas: individualaus gyvūno šlapimo tūris bei tankumas;

8.2.1.2. baltymų, gliukozės, ketonų, paslėpto kraujo kiekis (pusiau kiekybiškai);

8.2.1.3. nuosėdų mikroskopinis vaizdas (pusiau kiekybiškai).

8.3. Klinikinė chemija

8.3.1. Kas šeši mėnesiai ir tyrimo pabaigoje iš visų negraužikų bei 10 abiejų lyčių žiurkių, priklausančių visoms grupėms, jei įmanoma, iš tų pačių žiurkių tuo pačiu laiku surenkami kraujo mėginiai, kurie vėliau ištiriami.

8.3.2. Paėmus mėginius, atskiriama plazma, kurioje nustatomi tokie rodikliai:

8.3.2.1. bendra baltymo koncentracija;

8.3.2.2. albumino koncentracija;

8.3.2.3. kepenų funkciniai testai (tokie kaip šarminės fosfatazės aktyvumas, serumo alaninaminotransferazės aktyvumas, serumo aspartataminotransferazės aktyvumas, g – glutamiltranspeptidazės ir ornitino dekarboksilazės aktyvumas);

8.3.2.4. angliavandenių metabolizmas, įvertinant gliukozės kraujyje trūkumą;

8.3.2.5. inkstų funkciniai testai, tokie kaip kraujo karbamido nustatymas.

8.4. Skrodimas

8.4.1. Atliekamas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, įskaitant tuos, kurie krito bandymų metu arba buvo numarinti tada, kai buvo nustatyta, jog jie krenta. Prieš numarinimą paimami visų gyvūnų kraujo mėginiai, kad būtų atlikta diferencinė kraujo analizė. Visi akivaizdžiai matomi augliai, pakitę audiniai arba organai, kurie įtariami kaip augliai, turi būti užkonservuoti. Reikia ieškoti sąsajų tarp pagrindinių stebėjimų duomenų ir mikroskopinio vertinimo rezultatų.

8.4.2. Histopatologiniams tyrimams išsaugomi, laikant atitinkamoje terpėje, tokie audiniai ir organai: smegenys (sveria 10 kiekvienos lyties gyvūnų grupėje) - (pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūviai, smegenėlių ir smegenų žievė, hipofizė, tiroidinė liauka (įskaitant paratiroidinę liauką), užkrūčio liaukos audinys, plaučiai (trachėja), širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys (serumo alaninaminotransferazės aktyvumas), blužnis, inkstai (serumo alaninaminotransferazės aktyvumas), antinksčiai (serumo alaninaminotransferazės aktyvumas), stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, gaubiančioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, gimda, šlapimo pūslė, limfmazgiai, kasa, lytinės liaukos (serumo alaninaminotransferazės aktyvumas), pagalbiniai lytiniai organai, moterų pieno liauka, oda, raumenynas, periferinis nervas, stuburo smegenys (sprando, krūtinės ląstos ir juosmens), krūtinkaulis su kaulų čiulpais, šlaunikaulis (įskaitant ir segmentinį paviršių) ir akys.

8.4.3. Plaučių ir šlapimo pūslės pripildymas fiksuojančiąja medžiaga yra optimalus būdas išsaugoti šiuos audinius; plaučių pripildymas įkvėpimo bandymuose svarbus atitinkamiems histopatologiniams tyrimams atlikti. Įkvėpimo bandymo atveju išsaugomi visi kvėpavimo organai, įskaitant nosies ertmę, gerklas ir ryklę.

8.4.4. Jei atliekami kiti klinikiniai tyrimai, gauta informacija turi būti prieinama prieš atliekant mikroskopinę analizę, nes tai gali sudaryti ženklias gaires patologo darbui.

8.5. Histopatologinis tyrimas

8.5.1. Atliekant chroninio toksiškumo bandymą: detaliai ištirti visų, gavusių didelę dozę bei kontrolinių grupių gyvūnų užkonservuotus organus. Jei didelę dozę gavusioje papildomoje grupėje nustatomi su bandomąja medžiaga susiję patologiniai kitimai, tai bet kurios kitos bandomąja medžiaga veiktos grupės gyvūnų organai, veikti bandomąja medžiaga, turi būti visiškai histologiškai ištirti, tai turi būti padaryta ir bandomųjų grupių, atliekant kancerogeniškumo bandymą bei jo pabaigoje, atveju.

8.5.2. Atliekant kancerogeniškumo bandymą:

8.5.2.1. visų kontrolinės ir didžiausią dozę gavusių grupių gyvūnų odos, organų ir audinių visapusiškas histopatologinis įvertinimas;

8.5.2.2. visi akivaizdžiai matomi augliai, pakitę audiniai arba organai, kurie įtariami kaip augliai, mikroskopiškai ištiriami visose grupėse;

8.5.2.3. jei gavusios didelę dozę ir kontrolinė grupės skiriasi pagal neoplastinių sutrikimų pasireiškimą, tai ištiriami konkretūs šių grupių organai ar audiniai;

8.5.2.4. jei didelę dozę gavusioje grupėje gyvūnų išlikimas yra ženkliai mažesnis negu kontrolinėje, tai detaliai ištiriama kita, mažesnę dozę gavusi, grupė;

8.5.2.5. jei yra įrodymas, kad toksiniai ar kiti poveikiai turėjo įtaką neoplastiniam atsakui grupėje, gavusioje didelę dozę, tai detaliai ištiriama kita, mažesnę dozę gavusi, grupė.

II. DUOMENYS

9. Duomenys pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti augliai, bandymo metu, skaičius, auglių nustatymo laikas bei gyvūnų, kuriuose buvo nustatyti augliai numarinimo metu, skaičius. Skaitmeniniai rezultatai apdorojami tinkamais statistiniais metodais, kurie parenkami planuojant bandymą. Galima taikyti bet kokį pripažintą statistinio apdorojimo metodą.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

10. Bandymo protokolas. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:

10.1. rūšis, veislė, kamienas, gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir pan.;

10.2. tyrimo sąlygos:

10.2.1. poveikio sistemos aprašymas su smulkiomis techninėmis charakteristikomis; gyvūnų laikymo bandymo kameroje aprašymas; temperatūros, drėgmės, koncentracijos matuoklių aprašymas su techninėmis charakteristikomis;

10.2.2. veikimo metu gauti duomenys: pateikiami lentelėse, nurodant vidutines vertes ir variacijos matą (pavyzdžiui, standartinį nukrypimą) ir pateikiant:

10.2.2.1. oro srauto greičius per inhaliacijos prietaisą;

10.2.2.2. oro temperatūrą ir drėgmę;

10.2.2.3 vardines koncentracijas (bendras bandomosios medžiagos kiekis, įdėtas į inhaliacijos prietaisą, padalytas iš oro tūrio);

10.2.2.4. tirpiklio (jei naudotas) rūšis;

10.2.2.5. tikrąsias koncentracijas kvėpavimo zonoje bandymo metu;

10.2.2.6. vidutinius dalelių dydžius (jei įmanoma tai nurodyti);

10.2.2.7. dozes (įskaitant tirpiklį, jei taikytas) ir koncentracijas.

10.3. duomenys apie atsaką į toksinį poveikį, įskaitant toksiškumo požymius, pagal lytį ir dozę;

10.4. gyvūnų kritimo laikas bandymo metu arba gyvūnai, išgyvenę iki bandymo pabaigos;

10.5. toksiškumo požymiai atsižvelgiant į lytį ir dozę;

10.6. toksiškumo ir kitų poveikių aprašymas;

10.7. kiekvieno anormalinio požymio stebėjimo laikas ir jo tolesnė plėtra;

10.8. oftalmologinių stebėjimų duomenys;

10.9. duomenys apie šėrimą ir kūno masės kitimą;

10.10. atlikti hematologiniai tyrimai, palyginti su norma;

10.11. atlikti biocheminiai tyrimai (įskaitant šlapimo analizę), palyginti su norma;

10.12. skrodimo duomenys;

10.13. detalus histopatologinių pokyčių aprašymas;

10.14. statistinis rezultatų apdorojimas, kai tinka;

10.15. duomenų aptarimas;

10.16. duomenų interpretavimas.

11. Įvertinimas ir interpretacija. Šio metodo duomenų įvertinimas ir interpretacija pateikti Bendrajame įvade.

IV. NUORODOS

12. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade.

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B34 METODAS: TOKSIŠKUMO REPRODUKCIJAI VIENOS KARTOS BANDYMAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

2. Apibrėžimai. Šio metodo apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Pamatinės medžiagos. Nėra.

4. Bandymo metodo principas

4.1. Bandomoji medžiaga duodama laipsniškai keičiamomis dozėmis kelioms eksperimentinių grupių gyvūnams: patinams bei patelėms. Patinams dozės duodamos augimo metu ir pasibaigus vienai spermatogenezei (praėjus penkiasdešimt šešioms dienoms – pelių patinams ir septyniasdešimt dienų – žiurkių patinams), norint įvertinti bet kokius neigiamus bandomosios medžiagos poveikius spermatogenezei.

4.2. Tėvinės (P) kartos patelėms duodama dozė praėjus dviems rujoms, kad būtų galima įvertinti bet kokius neigiamus bandomosios medžiagos poveikius kiaušinėlių subrendimui. Tada gyvūnai suporuojami. Bandomoji medžiaga duodama abiejų lyčių gyvūnams poravimosi metu, vėliau duodama tik patelėms, nėštumo, o vėliau žindymo metu.

4.3. Medžiagos davimo įkvepiant metodą reikia modifikuoti.

5. Kokybės kriterijai. Nėra.

6. Bandymo metodo aprašymas

6.1. Pasiruošimas

6.1.1. Sveiki gyvūnų jaunikliai „aklos atrankos“ metodu atrenkami ir suskirstomi į bandomąją bei kontrolinę grupes. Penkias dienas prieš bandymą gyvūnai aklimatizuojami laboratorijos sąlygomis.

6.1.2. Bandomoji medžiaga duodama kartu su pašaru ar geriamuoju vandeniu. Galima naudoti ir kitus davimo būdus. Visiems gyvūnams bandomosios medžiagos dozė duodama taip pat atitinkamo eksperimentinio periodo metu. Jei dozavimui naudojamas tirpiklis ar kiti priedai, tai jie neturi sukelti toksinio poveikio.

6.1.3. Dozė duodama septynis kartus per savaitę.

6.2. Eksperimentiniai gyvūnai

6.2.1. Dažniausiai naudojamos pelės arba žiurkės. Naudojami sveiki gyvūnai, kurių atžvilgiu anksčiau nebuvo taikytos eksperimentinės procedūros. Bandomieji gyvūnai apibūdinami pagal rūšį, kamieną, lytį, masę ir/ar amžių.

6.2.2. Vaisingumui įvertininti, tiriami patinai ir patelės. Prieš pradedant duoti dozę, visi bandomieji bei kontroliniai gyvūnai atjunkomi.

6.3. Skaičius ir lytis. Gyvūnų skaičius bandomojoje ir kontrolinėje grupėse – dvidešimt apvaisintų patelių. Siekiama užtikrinti pakankamą vaisingumą ir prieauglio skaičių, norint įvertinti bandomosios medžiagos sugebėjimą daryti įtaką vislumui ir patelių elgesui tėvinės kartos (P) gyvūnuose nuo apvaisinimo iki subrendimo, pirmosios kartos (F₁) palikuonių žindymui, augimui bei vystymosi svarbą.

6.4. Bandymo sąlygos. Pašaras ir vanduo duodami pasirinktinai. Artėjant atsivedimui patelės atskiriamos, perkeliant jas į atsivedimui ar motinoms skirtus narvelius, kurie aprūpinti būtiniausiomis medžiagomis gūžtos susukimui.

6.5. Dozės. Naudojamos trys bandomosios bei kontrolinė grupės. Jei bandomoji medžiaga duodama, naudojant tirpiklį, tai kontrolinė grupė kartu su tirpikliu turi gauti didžiausią bandomosios medžiagos kiekį. Jei bandomoji medžiaga pasisavinama ar sunaudojama su pašaru sunkiai, naudojama gretutinė maitinama kontrolinė grupė. Neatsižvelgiant į bandomosios medžiagos fizikinę cheminę prigimtį ar biologinio veikimo ribotą efektą, didžiausia dozė turi sukelti toksiškumą bet ne mirtį tėvinės (P) kartos gyvūnų tarpe. Tarpinė bandomosios medžiagos dozė turi sukelti minimalų toksinį poveikį, o maža dozė neturi sukelti jokio pastebimo žalingo poveikio tėvams ar palikuonims. Kai kiekvienam gyvūnui medžiagos dozė duodama per zondą arba su kapsule, tai ji parenkama atsižvelgiant į kiekvieno gyvūno kūno masę ir kalibruojama kiekvieną savaitę priklausomai nuo kūno masės pokyčių. Nėštumo metu medžiagos davimas dozėmis patelėms pagrindžiamas kūno masės duomenimis nulinę arba šeštąją nėštumo dieną, jei to pageidaujama.

6.6. Kontrolė. Jei naudojant mažo toksiškumo medžiagas, dozė - 1000 mg/kilogramui – netrukdo dauginimuisi, tai laikomasi nuostatos, kad bandymas, naudojant kitas dozes, nėra būtinas. Jei išankstinio bandymo metu naudojama didelė dozė, sukelianti akivaizdų toksiškumą patelėse, nepažeidžia vaisingumo, tai laikomasi nuostatos, jog bandymas naudojant kitas dozes nėra būtinas.

7. Bandymo eiga

7.1. Dozavimas. Kasdienis dozės davimas tėvinės (P) kartos patinams prasideda, kai jie sulaukia 5–9 savaičių amžiaus, atjunkomi ir penkias dienas aklimatizuojami. Žiurkėms dozės davimas pratęsiamas dešimčiai savaičių, likusių iki suporavimo periodo (pelėms –pratęsiamas aštuonioms savaitėms). Poravimosi periodo pabaigoje patinai numarinami ir tiriami arba paliekami gyvi ir šeriami bandymo metu iki antrosios vados atsiradimo, po kurios jie numarinami bei tiriami prieš pasibaigiant bandymui. Tėvinės (P) kartos patelėms dozė pradedama duoti iškart po penkias dienas trukusios aklimatizacijos ir tęsiasi dvi savaites iki poravimosi periodo pradžios. Patelėms dozė duodama kiekvieną dieną tris savaites trunkančio poravimosi periodo bei nėštumo metu iki F₁ kartos palikuonių atjunkymo. Dozės davimo tvarkaraštis keičiamas, remiantis prieinama informacija apie bandomosios medžiagos sukeliamą metabolizmą arba bioakumuliaciją.

7.2. Poravimosi sąlygos

7.2.1. Bandant toksiškumo įtaką dauginimuisi, poruojama santykiu 1:1 (vienas patinas ir viena patelė) arba santykiu 1:2 (vienas patinas ir dvi patelės).

7.2.3. Nesusiporavę poros laikomos nevaisingomis. Todėl papildomai poruojama su kitais veisliniais patinais ar patelėmis, mikroskopiškai analizuojant dauginimosi organus ir tiriant kiaušinėlio ir spermatozoidų susiformavimo ciklą.

7.3. Vados dydis

7.3.1. Gyvūnams, kuriems vaisingumo tyrimo metu duodama dozė, leidžiama normaliai atsivesti palikuonių ir prižiūrėti juos iki atjunkymo, nestandartizuojant vados dydžio.

7.3.2. Atliekant vados dydžio standartizavimą, praėjus 1–4 dienoms po gimimo, kiekvienos vados dydis reguliuojamas, pašalinant perteklinį prieauglį „aklos atrankos“ metodu, kad vienoje vadoje liktų keturi patinėliai ir keturios patelės. Jei neįmanoma vienoje vadoje turėti po keturis kiekvienos lyties palikuonis, priimtinas dalinis palikuonių skaičiaus reguliavimas (pvz., penki patinėliai ir trys patelės). Vadų, kuriose yra mažiau nei aštuoni palikuonys, skaičius nereguliuojamas.

7.4. Stebėjimas

7.4.1. Bandymo metu kiekvienas gyvūnas stebimas kiekvieną dieną registruojant elgesio pokyčius, komplikuoto arba užsitęsusio nėštumo požymius ir visus toksiškumo požymius, įskaitant kritimą. Prieš poravimosi periodą ir jo metu kasdien įvertinamas pašaro suvartojimas. Pasibaigus gimdymui ir prasidėjus laktacijai, pasveriama vada įvertintinus pašaro suvartojimą (tuo pat metu įvertinamas geriamo vandens suvartojimas, jei bandomoji medžiaga duodama su vandeniu). Pirmąją dozės davimo dieną ir vėliau po savaitės pasveriami tėvinės (P) kartos patinai ir patelės. Stebėjimai, registruojami ištyrus kiekvieną gyvūną atskirai.

7.4.2. Nėštumo trukmė pradedama skaičiuoti nuo nulinės dienos. Kiekviena vada tiriama, norint nustatyti naujagimių lytį, gimimų skaičių ir pagrindines anomalijas.

7.4.3. Kritę ir ketvirtą dieną po gimimo numarinti jaunikliai tiriami, ieškant sutrikimų. Gimę jaunikliai pasveriami. Sveriama po ketvirtos bei septintos dienos ir po savaitės bei kol baigsis tyrimas, kiekvienas gyvūnas sveriamas atskirai. Registruojami fiziniai ar elgesio sutrikimai veislinėse patelėse bei jų palikuonyse.

8. Patologija

8.1. Skrodimas. Bandymo metu numarinus ar kritus tėvinės kartos (P) gyvūnams, jie makroskopiškai ištiriami, nustatomos bet kokios struktūrinės anomalijos ir patologiniai pakitimai, atkreipiant dėmesį į dauginimosi organus. Kritę ar gaištantys gyvūnai ištiriami, siekiant nustatyti sutrikimus.

8.2. Histopatologinis tyrimas

8.2.1. Mikroskopiškai ištiriami tėvinės (P) kartos gyvūnų kiaušidės, gimda, gimdos kaklelis, makštis, sėklidės, sėklidės prielipas, prostata, koaguliacijos liauka, hipofizis bei bandomąja medžiaga paveikti organai. Jei atliekant bandymą ir naudojant daug skirtingų dozių šie organai nebuvo tirti, tai jie mikroskopiškai ištiriami didelę dozę gavusiuose gyvūnuose, kontrolinės grupės gyvūnuose bei bandymo metu kritusiuose gyvūnuose, jei tai įmanoma.

8.2.2. Gyvūnų organai, kuriuose nustatytos anomalijos, ištiriami visuose likusiuose tėvinės (P) kartos gyvūnuose. Mikroskopiškai tiriami audiniai, kuriuose pastebėti pagrindiniai patologiniai pokyčiai. Gyvūnų, kurie, kaip įtariama, gali būti nevaisingi, dauginimosi organai tiriami mikroskopiškai.

II. DUOMENYS

9. Duomenys pateikiami apibendrintai, lentelėse, kuriose nurodomas kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, vaisingų bei nėščių patelių skaičius, pokyčių tipai ir gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pokyčiai, skaičius, išreikštas procentais.

10. Jei įmanoma, duomenys, išreikšti skaičiais, apdorojami pasitelkus bet kokį pripažintą statistinį metodą.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

11. Bandymo protokolas. Bandymo protokole pateikiama tokia informacija:

11.1. panaudota gyvūnų rūšis bei kamienas;

11.2. duomenys apie toksinį atsaką pagal bandytą lytį ir duotą dozę, įskaitant vaisingumą, nėštumą ir gyvybingumą;

11.3. jei įmanoma, tai dozės lygis, kuriam esant jokių pokyčių nebuvo pastebėta;

11.4. kritimo laikas bandymo metu arba jei gyvūnai išliko gyvi iki bandymo pabaigos;

11.5. toksinių ir kitų požymių apibūdinimas;

11.6. kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių stebėjimo laikas;

11.7. numarinimo laikas bandymo metu arba numatyto gyvūnų numarinimo, prieš užbaigiant bandymą, laikas,

11.8. lentelė, kurioje pateikiama kiekvienos vados kūno masė, jauniklių kūno masių vidurkiai ir kiekvieno jauniklio kūno masė bandymo pabaigoje;

11.9. toksiniai ar kiti pokyčiai, turintys įtakos dauginimuisi, palikuonims bei jų vystymuisi;

11.10. tėvinės (P) kartos gyvūnų kūno masė;

11.11. skrodimo metu gauti duomenys;

11.12. mikroskopinių tyrimų duomenų detalus apibūdinimas;

11.13. duomenų statistinė analizė, jeigu įmanoma tai padaryti;

11.14. duomenų aptarimas;

11.15. duomenų aiškinimas.

12. Įvertinimas ir interpretacija. Šio metodo duomenų įvertinimas ir interpretacija pateikti Bendrajame įvade.

IV. NUORODOS

13. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade.

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B35: TOKSIŠKUMO REPRODUKCIJAI DVIEJŲ KARTŲ BANDYMAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

2. Apibrėžimai. Šio metodo apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Pamatinės medžiagos. Nėra.

4. Bandymo metodo principas

4.1. Bandomoji medžiaga duodama laipsniškai keičiamomis dozėmis kelioms eksperimentinių grupių gyvūnams patinams bei patelėms. Tėvinės kartos (P) patinams dozės duodamos augimo metu ir pasibaigus vienai spermatogenezei (praėjus penkiasdešimt šešioms dienoms – pelių patinams ir septyniasdešimt dienų – žiurkių patinams), norint įvertinti bet kokius neigiamus bandomosios medžiagos poveikius spermatogenezei.

4.2. Tėvinės (P) kartos patelėms duodama dozė praėjus dviems rujoms, kad įvertinti bet kokius neigiamus bandomosios medžiagos poveikius kiaušinėlių subrendimui. Po to gyvūnai suporuojami. Bandomoji medžiaga duodama abejoms lytims poravimosi metu, vėliau duodama tik patelėms, iš pradžių nėštumo, o vėliau žindymo metu. Atjunkymo metu bandomoji medžiaga duodama (F₁) palikuonims, jiems augant iki subrendimo, poravimosi metu ir (F₂) kartai atsiradus iki (F₂) kartos atjunkymo.

4.3. Medžiagos davimo įkvepiant metodą reikia modifikuoti.

5. Kokybės kriterijai. Nėra.

6. Bandymo metodo aprašymas

6.1. Pasiruošimas. Prieš tyrimą sveiki gyvūnai „aklos atrankos“ metodu atrenkami ir suskirstomi į bandomąją bei kontrolinę grupes. Penkias dienas prieš bandymą tėvinės (P) kartos gyvūnai aklimatizuojami laboratorijos sąlygomis. Bandomoji medžiaga duodama kartu su pašaru ar geriamuoju vandeniu. Galima naudoti ir kitus davimo būdus. Visiems gyvūnams bandomosios medžiagos dozė duodama taip pat viso eksperimentinio periodo metu. Jei dozavimui naudojamas tirpiklis ar kiti priedai, tai jie neturi sukelti toksinio poveikio. Dozė duodama septynis kartus per savaitę.

6.2. Eksperimentiniai gyvūnai

6.2.1. Dažniausiai naudojamos pelės arba žiurkės. Naudojami sveiki tėvinės (P) kartos gyvūnai, kurių atžvilgiu anksčiau nebuvo taikytos eksperimentinės procedūros. Nenaudojami mažai vaisingi kamienai. Bandomieji gyvūnai apibūdinami pagal rūšį, kamieną, lytį, masę ir/ar amžių.

6.2.2. Vaisingumo įvertinimui tiriami patinai ir patelės. Prieš pradedant duoti dozę visi bandomieji bei kontroliniai gyvūnai atjunkomi.

6.3. Skaičius ir lytis. Gyvūnų skaičius bandomojoje ir kontrolinėje grupėse – dvidešimt apvaisintų patelių. Siekiama užtikrinti pakankamą nėštumo ir prieauglio skaičių, įvertinti bandomosios medžiagos sugebėjimą daryti įtaką vislumui, nėštumui ir patelių tėvinės (P) kartos elgesui F₁palikuonių žindymui, augimui ir vystymuisi nuo apvaisinimo iki subrendimo ir jų palikuonims (F₂) iki atjunkymo svarbą.

6.4. Bandymo sąlygos. Pašaras ir vanduo duodami pasirinktinai. Artėjant atsivedimui patelės atskiriamos, perkeliant jas atsivedimui ar motinoms skirtus narvelius, kurie aprūpinti būtiniausiomis medžiagomis gūžtos susukimui.

6.5. Dozės. Naudojamos trys bandomosios bei kontrolinė grupės. Jei bandomoji medžiaga duodama naudojant tirpiklį, tai kontrolinė grupė kartu su tirpikliu turi gauti didžiausią bandomosios medžiagos kiekį. Jei bandomoji medžiaga pasisavinamą ar sunaudojimą su pašaru sunkiai, naudojama gretutinė maitinama kontrolinė grupė. Neatsižvelgiant į bandomosios medžiagos fizikinę cheminę prigimtį ar biologinio veikimo ribotą poveikį, didžiausia dozė turi sukelti toksiškumą bet ne mirtį tėvinės (P) kartos gyvūnų tarpe. Tarpinė bandomosios medžiagos dozė turi sukelti minimalius toksinius poveikius, o maža dozė neturi sukelti jokių pastebimų žalingų poveikių tėvams ar palikuonims. Kai kiekvienam gyvūnui medžiagos dozė duodama per zondą arba su kapsule, tai ji parenkama atsižvelgiant į kiekvieno gyvūno kūno masę ir kalibruojama kiekvieną savaitę priklausomai nuo kūno masės pokyčių. Nėštumo metu medžiagos davimas dozėmis patelėms pagrindžiamas kūno masės duomenimis nulinę arba šeštąją nėštumo dieną, jei to pageidaujama.

6.6. Kontrolė. Jei naudojant mažo toksiškumo medžiagas, dozė - 1000 mg/ kilogramui – netrukdo dauginimuisi, tai laikomasi nuostatos, kad bandymas, naudojant kitas dozes, nėra būtinas. Jei išankstinio bandymo metu naudojama didelė dozė, sukelianti akivaizdų toksiškumą patelėse, nepažeidžia vaisingumo, tai laikomasi nuostatos, jog bandymas, naudojant kitas dozes nėra būtinas.

7. Bandymo eiga

7.1. Dozavimas

7.1.1. Kasdienis dozės davimas tėvinės (P) kartos patinams pradedamas, kai jie sulaukia 5–9 savaičių amžiaus, atjunkomi ir penkias dienas aklimatizuojami. Žiurkėms dozės davimas pratęsiamas dešimčiai savaičių, likusių iki suporavimo periodo (pelėms – pratęsiamas aštuonioms savaitėms). Poravimosi periodo pabaigoje patinai numarinami ir tiriami arba jie paliekami gyvi, kad patelės atsivestų antrąją vadą, po kurios jie numarinami bei tiriami prieš pasibaigiant tyrimui.

7.1.2. Tėvinės (P) kartos patelėms dozė pradedama duoti iškart po penkias dienas trukusios aklimatizacijos ir tęsiasi dvi savaites iki poravimosi periodo pradžios. Patelėms dozė duodama kiekvieną dieną tris savaites trunkančio poravimosi periodo bei nėštumo metu iki F₁ kartos palikuonių atjunkymo. Dozės davimo tvarkaraštis keičiamas, remiantis prieinama informacija apie bandomosios medžiagos sukeliamą metabolizmą arba bioakumuliaciją.

7.1.3. (F₁) kartos gyvūnams dozė pradedama duoti iškart po atjunkymo iki numarinimo.

7.2. Poravimosi sąlygos

7.2.1. Bandant toksiškumo įtaką dauginimuisi, poruojama arba santykiu 1:1 (vienas patinas ir viena patelė) arba santykiu 1:2 (vienas patinas ir dvi patelės).

7.2.2. Poruojant santykiu 1:1, viena patelė laikoma kartu su vienu patinu, kol prasideda nėštumas arba praeina trys savaitės. Kiekvieną rytą patelės tiriamos, ieškant spermos arba makšties išskyrų. Nulinė nėštumo diena yra ta, kai randama sperma arba makšties išskyros. Atsižvelgiant į spermatogenezę, nereikia poruoti (F₁) kartos palikuonių, kol jie nesulaukia vienuolikos savaičių amžiaus (pelės) arba trylikos savaičių (žiurkės). Poruojant (F₁) palikuonis, iš kiekvienos vados „aklos atrankos“ metodu parenkamas vienas patinas bei viena patelė, tam, kad jie būtų kryžmiškai suporuojami su kitos vados jaunikliais, gaunančiais tą pačią dozę ir kad atsirastų antroji (F₂) palikuonių karta. Pirmos kartos (F₁) patinai ir patelės, kurie nebuvo atrinkti suporavimui, numarinami atjunkymo metu.

7.2.3. Poros, kurios nesusiporavo, laikomos nevaisingomis. Todėl papildomai poruojama su kitais veisliniais patinais ar patelėmis, mikroskopiškai analizuojant dauginimosi organus ir tiriant kiaušinėlio ir spermatozoidų susiformavimo ciklą.

7.3. Vados dydis

7.3.1. Gyvūnams, kuriems vaisingumo tyrimo metu duodama dozė, leidžiama normaliai atsivesti palikuonių ir prižiūrėti juos iki atjunkymo, nestandartizuojant vados dydžio.

7.3.2. Atliekant vados dydžio standartizavimą, praėjus vienai–keturioms dienoms po gimimo, kiekvienos vados dydis reguliuojamas pašalinant perteklinį prieauglį „aklos atrankos“ metodu, kad vienoje vadoje liktų keturi patinėliai ir keturios patelės. Jei neįmanoma vienoje vadoje turėti po keturis kiekvienos lyties palikuonis, priimtinas dalinis palikuonių skaičiaus reguliavimas (pvz., penki patinėliai ir trys patelės). Vadų, kuriose yra mažiau nei aštuoni palikuonys, skaičius nereguliuojamas. Antros kartos (F₂) vadų dydžio reguliavimas atliekamas tokiu pačiu būdu.

7.4. Stebėjimas

7.4.1. Bandymo metu kiekvienas gyvūnas stebimas kiekvieną dieną registruojant elgesio pokyčius, komplikuoto arba užsitęsusio nėštumo požymius ir visus toksiškumo požymius, įskaitant kritimą. Prieš poravimosi periodą ir jo metu, nėštumo metu kiekvieną dieną įvertinamas pašaro suvartojimas. Pasibaigus gimdymui ir prasidėjus laktacijai, pasveriama vada įvertinant pašaro suvartojimą. Pirmąją dozės davimo dieną ir vėliau po savaitės pasveriami tėvai (P ir F₁kartos). Stebėjimai registruojami ištyrus kiekvieną gyvūną atskirai.

7.4.2. Nėštumo trukmė pradedama skaičiuoti nuo nulinės dienos. Kiekviena vada tiriama, norint nustatyti naujagimių lytį, gimimų skaičių ir pagrindines anomalijas.

7.4.3. Kritę ir ketvirtą dieną po gimimo numarinti jaunikliai tiriami, ieškant sutrikimų. Gyvi naujagimiai suskaičiuojami ir vados pasveriamos gimimo rytą, po ketvirtos bei septintos dienos ir po savaitės bei sveriami, kol baigsis bandymas, kiekvienas gyvūnas sveriamas atskirai. Registruojami fiziniai ar elgesio sutrikimai veislinėse patelėse bei jų palikuonyse.

8. Patologija

8.1. Skrodimas

8.1.1. Visi tėvinės (P) ir pirmosios palikuonių kartos (F₁) gyvūnai numarinami, kai jų nebereikia įvertinant bandomosios medžiagos poveikį dauginimuisi. Atjunkymo metu numarinami F₁ palikuonys, kurie nebuvo atrinkti suporavimui, taip pat ir (F₂) palikuonys.

8.1.2. Bandymo metu numarinus ar kritus visiems tėvams (P ir F₁ kartų gyvūnams), jie mikroskopiškai ištiriami, kad būtų nustatytos bet kokios struktūrinės anomalijoss ar patologiniai pakitimai, atkreipiant dėmesį į dauginimosi organus. Kritę ar gaištantys jaunikliai ištiriami, siekiant nustatyti sutrikimus.

8.2. Histopatologinis tyrimas

8.2.1. Mikroskopiškai ištiriami visų tėvų (P ir F₁ kartų gyvūnų) kiaušidės, gimda, gimdos kaklelis, makštis, sėklidės, sėklidės prielipas, prostata, koaguliacijos liauka, hipofizis bei bandomąja medžiaga paveikti organai. Jei atliekant tyrimus ir naudojant daug skirtingų dozių šie organai nebuvo tirti, jie mikroskopiškai ištiriami didelę dozę gavusiuose kontroliniuose (P ir F₁) gyvūnuose, atrinktuose suporavimui bei bandymo metu nugaišusiuose gyvūnuose, jei tai įmanoma.

8.2.2. Gyvūnų organai, kuriuose buvo nustatytos anomalijos, ištiriami kitas dozes gavusiuose gyvūnuose. Mikroskopiškai tiriami audiniai, kuriuose pastebėti pagrindiniai patologiniai pokyčiai. Gyvūnų, kurie, kaip įtariama, gali būti nevaisingi, dauginimosi organai tiriami mikroskopiškai.

II. DUOMENYS

9. Duomenys pateikiami apibendrintai lentelėse, kuriose nurodomas kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, vaisingų bei nėščių patelių skaičius, pokyčių tipai ir gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pokyčiai, skaičius, išreikštas procentais.

10. Jei įmanoma, tai duomenys, išreikšti skaičiais, turėtų būti apdorojami, pasitelkus atitinkamą statistinį metodą. Reikėtų panaudoti bet kokį visuotinai naudojamą statistinį metodą.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

11. Bandymo protokolas. Bandymo protokole pateikiama tokia informacija:

11.1. panaudota gyvūnų rūšis bei kamienas;

11.2. duomenys apie toksinį atsaką pagal bandytą lytį ir duotą dozę, įskaitant vaisingumo, nėštumo ir gyvybingumo rodiklius;

11.3. jei įmanoma, tai dozės lygis, kuriam esant jokių pokyčių nebuvo pastebėta;

11.4. kritimo laikas bandymo metu arba jei gyvūnai išliko gyvi iki tyrimo pabaigos;

11.5. lentelė, kurioje pateikiamos kiekvienos vados, vidutinė jauniklio ir kiekvieno jauniklio kūno masės tyrimo pabaigoje;

11.6. dauginimąsi, palikuonis bei augimą po gimimo, lemiantys toksiniai ir kiti poveikiai;

11.7. kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių stebėjimo laikas;

11.8. tėvinės (P) kartos gyvūnų ir pirmos (F₁)kartos palikuonių, atrinktų suporavimui, kūno masės;

11.9. skrodimo metu gauti duomenys;

11.10. mikroskopinių tyrimų duomenų detalus apibūdinimas;

11.11. duomenų statistinė analizė, jei įmanoma tai padaryti;

11.12. duomenų aptarimas.

11.13. duomenų aiškinimas.

12. Įvertinimas ir aiškinimas. Šio metodo duomenų įvertinimas ir interpretacija pateikti Bendrajame įvade.

IV. NUORODOS

13. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade.

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B36 METODAS: TOKSIKOKINETIKA

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

2. Apibrėžimai. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Pamatinės medžiagos. Nėra.

4. Bandymo metodo principas

4.1. Tiriamoji medžiaga duodama atsižvelgiant į tyrimo tikslą tam tikrais periodais, paviene ar kartotinėmis dozėmis, eksperimentinių grupių gyvūnams. Vėliau priklausomai nuo tyrimo tipo kūno skysčiuose, audiniuose ir/ar ekskretuose nustatoma medžiaga ir/ar jos metabolitai.

4.2. Galima tirti „nežymėtas“ ir „žymėtas“ tiriamosios medžiagos formas. Jei naudojama žymė, tai ji į tiriamąją medžiaga įvedama taip, kad būtų galima gauti kuo išsamesnės informacijos apie junginio likimą.

5. Kokybės kriterijai. Nėra.

6. Bandymo metodo aprašymas

6.1. Pasiruošimas. Penkias dienas prieš tyrimą sveiki jauni gyvuliukai aklimatizuojami laboratorinėmis sąlygomis. Prieš pradedant tyrimą, gyvūnai „aklos atrankos“ metodu atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes. Ypatingais atvejais galima naudoti labai jaunus gyvūnus, nėščias pateles bei gyvūnus, iš anksto paveiktus tiriamąja medžiaga.

6.1.1. Eksperimentiniai gyvūnai. Toksikokinetiniai tyrimai atliekami, panaudojant vieną ar daugiau atitinkamų gyvūnų rūšių atsižvelgiant į rūšis, kurios yra naudojamos ir kurios pasirinktos naudoti kituose tos pačios tiriamosios medžiagos toksikologiniuose tyrimuose. Jei teste naudojami graužikai, tai jų kūno masės variacija neturėtų viršyti ± 20 % kūno masės vidurkio.

6.1.2. Skaičius ir lytis.

6.1.2.1. Atliekant absorbcijos ir ekskrecijos tyrimus, iš pradžių kiekvienoje grupėje, kuriai duodama skirtinga dozė, turi būti po keturis gyvūnus. Lyties pasirinkimas nėra būtinas, tačiau ypatingais atvejais tiriami abiejų lyčių gyvūnai. Jei egzistuoja lyčių skirtumai pagal atsaką, tai tiriami po keturis kiekvienos lyties gyvūnus. Tiriant negraužikus, galima naudoti tik keletą gyvūnų.

6.1.2.2. Kai tiriamas medžiagos pasiskirstymas audiniuose, tyrimo pradžioje reikia atsižvelgti į grupės dydį pagal gyvūnų, kurie bus numarinti numatytu laiko momentu, ir laiko momentų, kurių metu bus tiriami gyvūnai, skaičių.

6.1.2.3. Kai tiriamas metabolizmas, tai grupės dydis priklauso nuo tyrimo poreikių.

6.1.2.4. Atliekant daugelio dozių ir daugelio laiko momentų tyrimus, atsižvelgiama į grupės dydį pagal laiko momentus ir numatomus numarinimus, tačiau grupėje turi būti ne mažiau kaip du gyvūnai. Grupė turi būti pakankamai didelė, kad būtų galima tinkamai apibūdinti tiriamosios medžiagos ir/ar metabolitų pasisavinimą, stabilizavimąsi bei pašalinimą.

6.1.3. Dozė

6.1.3.1. Kai duodama pavienė dozė, tai mažiausiai dvi jos koncentracijos turėtų būti

naudojamos. Turėtų būti duodama maža, nesukelianti toksinio poveikio, dozė ir didelė dozė, kuriai esant pasireiškia toksinis poveikis arba galėtų pakisti toksikokinetiniai parametrai.

6.1.3.2. Kai duodama pakartotinė dozė, užtenka tik mažos koncentracijos dozės, tačiau ypatingais atvejais naudojama ir didelės koncentracijos dozė.

6.1.4. Davimo būdas

6.1.4.1. Toksikokinetinių tyrimų metu naudojamas tas pats davimo būdas ir, jei reikia, tas pats prietaisas, kuris buvo naudojamas ar buvo pasirinktas naudoti kituose toksikologiniuose tyrimuose. Tiriamoji medžiaga eksperimentiniams gyvūnams duodama per os su zondu ar pašaru, užnešama ant odos arba duodama įkvėpti konkrečiais laiko momentais. Tiriamosios medžiagos intraveninė injekcija naudinga, siekiant nustatyti santykinę medžiagos, duodamos kitais būdais, absorbciją. Be to, atlikus tiriamosios medžiagos intraveninę injekciją, gaunama naudinga informacija apie jos pasiskirstymą.

6.1.4.2. Reikia apsvarstyti galimybę, kai priemonė gali trukdyti tiriamosios medžiagos davimui. Atkreipti dėmesį į absorbcijos skirtumus, kai tiriamosios medžiagos duodamos per zondą ir su pašaru, ir būtent nustatyti tikslią tiriamosios medžiagos, duodamos su pašaru, dozę.

6.1.5. Stebėjimai. Gyvūnai stebimi kiekvieną dieną bei registruojami toksiškumo požymiai ir kiti svarbūs klinikiniai parametrai, įskaitant efektų pasireiškimo laiką, laipsnį bei trukmę.

6.2. Procedūra. Pasvėrus visus tiriamuosius gyvūnus, atitinkamu būdu jiems duodama tiriamoji medžiaga. Jeigu reikia, tai, prieš duodant medžiagą, tiriamieji gyvūnai įtvirtinami.

6.2.1. Absorbcija. Duodamos medžiagos absorbcijos greitis bei apimtis įvertinami įvairiais metodais, panaudojant arba nenaudojant kontrolinių grupių:

6.2.1.1. nustatant tiriamosios medžiagos ir/ar metabolitų kiekį ekskretuose, tokiuose kaip šlapimas, tulžis, išmatos, iškvėptas oras ir tai, kas gyvūno lavone be vidurių;

6.2.1.2. lyginant tiriamąją ir kontrolinę arba tiriamąją ir etaloninę grupes pagal biologinį atsaką (pvz., atliekant ūmaus toksiškumo tyrimus);

6.2.1.3. lyginant tiriamąją ir etaloninę grupes pagal tiriamosios medžiagos ekskreciją per inkstus;

6.2.1.4. nustatant tiriamosios medžiagos ir/ar metabolitų zoną, esančią žemiau plazmos ir laiko kreivės, ir gautus duomenis lyginant su etaloninės grupės tyrimų duomenimis.

6.2.2. Pasiskirstymas. Galimi du medžiagos pasiskirstymo analizės atlikimo būdai:

6.2.2.1. tiriant visą kūną autoradiografijos metodu, gaunama naudingos kokybinės informacijos;

6.2.2.2. pasibaigus veikimui tiriamąja medžiaga, skirtingu laiko momentu numarinant gyvūnus bei nustatant tiriamosios medžiagos ir/ar metabolitų kiekį bei koncentraciją audiniuose ir organuose, gaunama kiekybinė informacija.

6.2.3. Ekskrecija.

6.2.3.1. Tiriant ekskreciją, surenkamas šlapimas, išmatos, iškvėptas oras ir tam tikrais atvejais tulžis. Pasibaigus veikimui tiriamąja medžiaga, kelis kartus nustatomas tiriamosios medžiagos ir/ar metabolitų kiekis šiuose ekskretuose tol, kol ekskrecijos būdu pasišalins apie 95 % duotos medžiagos arba kai praeis savaitė.

6.2.3.2. Ypatingais atvejais apsvarstoma tiriamosios medžiagos ekskrecija į laktacijos tyrime naudojamų gyvūnų pieną.

6.2.4. Metabolizmas.

6.2.4.1. Biologiniai mėginiai tiriami atitinkamais metodais, kad būtų nustatytas metabolizmo apimtis bei pobūdis. Nustatoma metabolitų struktūra bei pasiūlomi galimi metabolitinės apykaitos keliai, jei anksčiau atliktų toksikologinių tyrimų metu liko neišspręstų problemų. Tyrimai in vitro padeda gauti informacijos apie metabolitinės apykaitos kelius.

6.2.4.2. Detalesnę informaciją apie metabolizmo ir toksiškumo sąsają galima gauti atlikus tokius biocheminius tyrimus, kaip metabolitinių fermentinių sistemų efektų tyrimai, endogeninių nebaltyminės kilmės sulfhidrilinių junginių pasišalinimo analizė bei tiriamosios medžiagos susirišimo su makromolekulėmis tyrimas.

II. DUOMENYS

7. Atsižvelgiant į atlikto tyrimo pobūdį, duomenys pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles ir, jei reikia, tai pateikiant papildomai ir paveikslus. Kiekvienos tirtos grupės atveju reikėtų nurodyti, jei to reikalaujama, laiko, dozės bei medžiagos pasiskirstymo audiniuose bei organuose matavimų vidurkius ir statistines variacijas. Absorbcijos laipsnis bei ekskrecijos apimtis ir greičiai nustatomi atitinkamais metodais. Kai atliekami metabolizmo tyrimai, pateikiama identifikuotų metabolitų struktūra bei galimus metabolitinės apykaitos kelius.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

8. Tyrimo ataskaita. Jei įmanoma, tai tyrimo ataskaitoje pateikiama tokia informacija:

8.1. panaudota rūšis, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos;

8.2. žymėtų medžiagų, jei šios buvo naudojamos, apibūdinimas;

8.3. dozės ir kaip dažnai jos buvo duodamos;

8.4. davimo būdas ir bet kokie prietaisai, jei buvo naudoti;

8.5. užregistruoti toksiniai ir kiti efektai;

8.6. tiriamosios medžiagos ir/ar metabolitų biologiniuose mėginiuose, įskaitant iškvėptą orą, nustatymo metodai;

8.7. lyties, dozės, režimo, laiko, audinių bei organų atžvilgiu atliktų matavimų išdėstymas paeiliui;

8.8. ekskrecijos ir absorbcijos apimties laiko ribose pateikimas;

8.9. metabolitų identifikacijos biologiniuose mėginiuose bei apibūdinimo metodai;

8.10. biocheminiai metabolizmo įvertinimo metodai;

8.11. galimi metabolitinės apykaitos keliai;

8.12. rezultatų aptarimas;

8.13. rezultatų interpretavimas.

9. Įvertinimas ir aiškinimas. Šio metodo duomenų įvertinimas ir aiškinimas pateikti Bendrajame įvade.

IV. NUORODOS

10. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade.

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B37 METODAS: ORGANINIŲ FOSFORO JUNGINIŲ UŽDELSTAS NEUROTOKSIŠKUMAS PO ŪMAUS POVEIKIO

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Įvadas

1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 418 metodu.

1.2. Vertinant toksinius medžiagų poveikius reikia žinoti, kad kai kurios medžiagų klasės sukelia specifinius neurotoksiškumo požymius, nenustatomus įprastais toksiškumo tyrimais. Pavyzdžiui, kai kurie organiniai fosforo junginiai sukelia uždelstą neurotoksiškumą, todėl vertinant šios grupės medžiagas reikia į tai atsižvelgti.

1.3. Nustatant medžiagas, sukeliančias uždelstą polineuropatiją, gali būti taikomi atrankos tyrimai in vitro, tačiau neigiami tyrimo in vitro duomenys dar neįrodo, kad medžiaga yra ne neurotoksiška. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

2. Apibrėžimai

2.1. Organiniai fosforo junginiai apima organinius fosforo esterius, tioesterius ar anhidridus, pagamintus iš organinių fosfono, fosforamido ar giminingų tiofosforo, tiofosforono ar tiofosforamido rūgščių ar kitas medžiagas, galinčias sukelti uždelstą neurotoksiškumą, būdingą šiai medžiagų klasei.

2.2. Uždelstas neurotoksiškumas – sindromas, susijęs su ataksijos, nugaros smegenų ir periferinio nervo distalinės aksonopatijos ilgai trunkančiu uždelsimu bei neuropatijos sukeltu esterazės slopinimu nervų audiniuose.

3. Kontrolinės medžiagos

3.1. Norint parodyti, kad laboratorinėmis sąlygomis tiriamųjų rūšių atsakas reikšmingai nesikeičia, pozityvinė kontrolės grupė gali gauti kontrolinę medžiagą.

3.2. Plačiai naudojamas neurotoksinas yra tri-o-tolilfosfatas (CAS Nr. 78-30-8, EINECS Nr. 201-103-5, CAS nomenklatūra: fosforo rūgštis, tris(2-metilfenil)esteris), sinonimas: tris-o-krezilfosfatas.

4. Bandymo metodo principas

4.1. Naminėms vištoms, kurios, jeigu reikia, yra apsaugotos nuo ūmaus cholinerginio poveikio, per virškinamąjį traktą duodama tiriamosios medžiagos vienkartinė dozė. 21 dieną stebimi jų elgesio nukrypimai, ataksija ir paralyžius. Paprastai praėjus 24 ir 48 valandoms po dozavimo, atsitiktiniu atrankos būdu paimtoms iš kiekvienos grupės vištoms atliekami biocheminiai tyrimai, t. y. nustatomas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimas. Praėjus 21 dienai po medžiagos poveikio, likusios vištos humaniškai numarinamos ir tam tikri nervų audiniai ištiriami histopatologiškai.

5. Bandymo metodo aprašymas

5.1. Sveikos jaunos suaugusios vištos, nesirgusios virusinėmis ligomis ir negydytos, neturinčios eisenos pakitimų, atsitiktinės atrankos principu paskirstomos į tiriamąją ir kontrolinę grupes ir mažiausiai 5 dienas iki tyrimo aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Reikia jas laikyti gana dideliuose narvuose arba aptvaruose, kuriuose vištos galėtų laisvai judėti ir būtų galima stebėti jų eiseną.

5.2. Tiriamoji medžiaga turi būti dozuojama per virškinamąjį traktą naudojant zondą, želatinines kapsules arba panašiu metodu. Skysčiai gali būti leidžiami neskiesti arba ištirpinti tirpiklyje tokiame, kaip kukurūzų aliejus. Didelės dozės kietųjų medžiagų želatininėse kapsulėse gali būti neefektyviai absorbuojamos, jas reikėtų ištirpinti. Naudojamo tirpiklio (ne vandens) toksinės savybės turi būti žinomos, o jeigu nežinomos, tai prieš tyrimą jos turi būti nustatytos.

5.3. Bandymo sąlygos

5.3.1. Eksperimentiniai gyvūnai

Rekomenduojamos 8–12 mėnesių amžiaus standartinio dydžio, linijos ir naminės veislės vištos (Gallus gallus domesticus), dedančios kiaušinius. Vištos turi būti užaugintos sąlygomis, leidžiančiomis joms laisvai judėti.

5.3.2. Skaičius ir lytis

5.3.2.1. Be tiriamosios grupės, turi būti dar tirpiklio kontrolinė bei pozityvinės kontrolės grupės. Su tirpiklio kontrolinės grupės gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat, kaip ir su tiriamaisiais gyvūnais, išskyrus tai, kad jie negautų tiriamosios medžiagos. Kiekvienoje grupėje reikia panaudoti tiek vištų, kad mažiausiai šešias galima būtų humaniškai numarinti (po tris, praėjus dviems skirtingiems laiko tarpams) biocheminiams tyrimams ir kad po 21 stebėjimo dienos patologiniams tyrimams išgyventų dar šešios vištos.

5.3.2.2. Pozityvinės kontrolės grupė gali būti tiriama paraleliai su kitomis grupėmis arba gali būti panaudojama nesena kontrolės grupė. Šioje grupėje turi būti mažiausiai šešios vištos, paveiktos žinomais uždelsto veikimo neurotoksinais, trys vištos skirtos biocheminiams ir trys – patologiniams tyrimams. Rekomenduojama periodiškai atnaujinti kontrolės duomenis. Kai tyrimo laboratorija pakeičia keletą esminių tyrimo elementų (pvz., vištų veislę, pašarus, laikymo sąlygas), turi būti gauti nauji pozityvinės kontrolės duomenys.

5.3.3. Dozių lygiai

5.3.3.1. Pagrindiniame bandyme naudotinų dozių lygių nustatymui reikalingas įvadinis tyrimas su atitinkamu vištų ir dozių grupių skaičiumi. Nustatant pagrindinio bandymo dozės ribas, įvadiniame bandyme yra būtinos kelių paukščių žūtys. Norint užkirsti kelią dėl ūmaus cholinerginio poveikio kylančioms žūtims, galima naudoti atropiną ar kitą apsauginę medžiagą, kuri netrukdytų uždelsto neurotoksiškumo atsakams.

5.3.3.2. Apskaičiuojant didžiausią toleruojamą tiriamosios medžiagos dozę, galima panaudoti daugybę tiriamųjų metodų (žiūrėti B1² metodą). Parenkant dozę, gali būti naudingi jau turimi vištų duomenys arba bet kokia kita toksikologinė informacija.

5.3.3.3. Atsižvelgiant į įvadinio bandymo rezultatus ir aukščiausią ribinę 2 000 mg/kg kūno masės dozę, tiriamosios medžiagos dozės lygis pagrindiniame bandyme turi būti kuo aukštesnis. Bet kokia žūtis per 21 dieną turi nepakeisti reikalingo išgyvenusių paukščių skaičiaus: šešių biocheminiams ir šešių histologiniams tyrimams. Užkertant kelią dėl ūmaus cholinerginio poveikio kylančioms žūtims, galima naudoti atropiną arba bet kurią kitą apsauginę medžiagą, netrukdančią uždelsto neurotoksiškumo atsakams.

5.3.4. Ribinis bandymas

5.3.4.1. Jeigu tirtas dozės lygis, ne žemesnis kaip 2 000 mg/kg kūno masės, nesukelia pastebimų toksinių poveikių ir jeigu pagal turimus duomenis apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, didesnių dozių tyrimai nebūtini.

5.3.4.2. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia naudoti didesnes dozes.

5.3.5. Stebėjimo periodas. Stebėjimo periodas turi trukti 21 dieną.

5.3.6. Darbo eiga

5.3.6.1. Kai paukštis gauna apsauginę medžiagą, kuri užkerta kelią galimai žūčiai dėl ūmaus cholinerginio poveikio, duodama tiriamosios medžiagos vienkartinė dozė.

5.3.6.2. Bendrasis stebėjimas. Stebėti reikia tuoj pat po medžiagos davimo. Pirmas dvi dienas visos vištos atidžiai stebimos kelis kartus, o vėliau mažiausiai vieną kartą per dieną, kol jos humaniškai numarinamos arba praeina 21 diena. Visi toksiškumo požymiai turi būti registruojami, žymint jų pradžią, tipą, ryškumą ir elgesio nukrypimų trukmę. Ataksiją reikėtų vertinti mažiausiai pagal keturių lygių skalę, reikėtų žymėti paralyžių. Norint pastebėti minimalų toksinį poveikį, vištos, atrinktos patologijai, mažiausiai du kartus per savaitę išimamos iš narvų ir stebimas jų aktyvumas, priverčiant jas judėti, pvz., kopėčiomis. Dvesiantys ir patiriantys dideles kančias bei skausmą paukščiai išimami iš narvų, pažymimi, humaniškai numarinami ir skrodžiami.

5.3.6.3. Kūno masė. Prieš tiriamosios medžiagos davimą visas vištas reikia pasverti, vėliau sveriama mažiausiai vieną kartą per savaitę.

5.3.6.4. Biochemija

5.3.6.4.1. Atsitiktinės atrankos būdu šešios vištos iš kiekvienos tiriamosios ir tirpiklio kontrolinių grupių bei trys vištos iš pozityvinės kontrolinės grupės (jei ši grupė paraleliai tiriama) kelios dienos po dozavimo humaniškai numarinamos, išimamos galvos smegenys ir juosmens dalies nugaros smegenys bei ištiriamas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimo aktyvumas. Kartais naudinga ištirti sėdimojo nervo audinio neuropatijos sukeltą esterazės slopinimo aktyvumą. Paprastai, praėjus 24 valandoms, humaniškai numarinami trys kontrolinės ir trys tiriamosios grupės paukščiai, o praėjus 48 valandoms, dar po tris, tuo tarpu trys pozityvinės kontrolės vištos humaniškai numarinamos po 24 valandų.

5.3.6.4.2. Jeigu klinikiniai intoksikacijos požymiai (tai visada gali būti nustatyta stebint cholinerginių požymių pradžios laiką) rodo, kad toksinė medžiaga veikia labai lėtai, tada geriau paukščių audinių pavyzdžius imti du kartus tarp 24 ir 72 valandų po dozavimo. Taip pat galima tirti acetilcholinesterazę (AChE). Tačiau gali įvykti spontaninė AChE reaktyvacija in vivo, o tai gali nulemti nepakankamą medžiagos, kaip AChE inhibitoriaus, įvertinimą.

5.3.6.5. Bendrasis skrodimas. Visų gyvūnų bendrojo skrodimo metu reikia apžiūrėti galvos bei nugaros smegenų išvaizdą.

5.3.6.6. Histopatologinis ištyrimas. Išgyvenusių visą stebėjimo periodą ir nepanaudotų biocheminiams tyrimams paukščių nervų audiniai turi būti mikroskopiškai ištirti. Audiniai turi būti fiksuojami in situ, naudojant perfuzijos techniką. Įtraukiama smegenėlių (vidurinįjį-pailgąjį lygį), pailgųjų smegenų, nugaros smegenų ir periferinių nervų dalis. Iš viršutinio kaklo segmento, vidurinės-krūtininės ir juosmens-kryžmens dalių paimamos nugaros smegenų atkarpos. Paimamos blauzdikaulio nervo distalinės ir jo atšakų į skrandžio raumenį bei sėdimojo nervo atkarpos. Šias atkarpas reikia dažyti būdingais mielinui ir specifiniais aksonui dažais.

II. DUOMENYS

6. Pasirinktų metodų (biochemijos, histopatologijos ir elgesio stebėjimo) gauti neigiami rezultatai paprastai nereikalauja uždelsto neurotoksiškumo tyrimo tęsimo. Tik gauti dviprasmiški arba negalutiniai rezultatai gali pareikalauti tolesnio įvertinimo.

7. Turi būti pateikiami kiekvieno paukščio duomenys. Visi duomenys turi būti pateikiami lentelių forma, nurodant kiekvienoje tirtoje grupėje tyrimo pradžioje buvusių paukščių skaičių, paukščių skaičių su pažeidimais, elgesio ar biocheminiais pakitimais, šių pažeidimų ar pakitimų tipus ir jų sunkumo laipsnį bei paukščių procentą su kiekvieno pažeidimo ar pakitimo tipu ir sunkumo laipsniu.

8. Gautus duomenis reikia vertinti pagal pakitimų pasireiškimą ir sunkumo laipsnį bei nustatant koreliacinius ryšius tarp elgesio, biocheminių ir histopatologinių pakitimų bei visų kitų pastebėtų pakitimų tiriamojoje ir kontrolinėje grupėse.

9. Skaitmeniniai rezultatai turi būti apdoroti tinkamais ir priimtinais statistiniais metodais. Statistiniai metodai turėtų būti pasirinkti planuojant tyrimą.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

10. Bandymo protokolas. Bandymo protokole, jeigu įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija.

10.1. Tiriamieji gyvūnai.

10.1.1. Panaudotos linijos.

10.1.2. Skaičius ir amžius.

10.1.3. Gavimo šaltinis, laikymo sąlygos ir kt.

10.1.4. Kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje.

10.2. Tyrimo sąlygos.

10.2.1. Informacija apie tiriamosios medžiagos paruošimą, pastovumą ir homogeniškumą, jei to reikalaujama.

10.2.2. Tirpiklio pasirinkimo pagrindimas.

10.2.3. Informacija apie poveikį tiriamąja medžiaga.

10.2.4. Informacija apie pašarų ir vandens kokybę.

10.2.5. Dozės pasirinkimo pagrindimas.

10.2.6. Duotų dozių detalizavimas, taip pat naudotas tirpiklis, jo tūris ir medžiagos fizikinė būklė.

10.2.7. Informacija apie naudotas apsaugines medžiagas ir poveikį jomis.

10.3. Duomenys.

10.3.1. Kūno masės duomenys.

10.3.2. Grupės toksinio atsako duomenys ir žuvimai.

10.3.3. Klinikiniai pokyčiai, sunkumo laipsnis ir trukmė (grįžtamieji ir negrįžtamieji).

10.3.4. Smulkus biocheminių metodų ir gautų duomenų aprašymas.

10.3.5. Skrodimo duomenys.

10.3.6. Smulkus visų gautų histopatologinių duomenų aprašymas.

10.3.7. Statistinis duomenų apdorojimas ten, kur tinka.

11. Duomenų aptarimas.

12. Išvados.

IV. NUORODOS

13. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade.

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B38 METODAS: ORGANINIŲ FOSFORO JUNGINIŲ UŽDELSTO NEUROTOKSIŠKUMO 28 DIENŲ BANDYMAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Įvadas

1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 419 metodu.

1.2. Vertinant toksinius medžiagų poveikius reikia žinoti, kad kai kurios medžiagų grupės sukelia specifinius neurotoksiškumo tipus, nenustatomus įprastais toksiškumo tyrimais. Pavyzdžiui, kai kurie organiniai fosforo junginiai sukelia uždelstą neurotoksiškumą, todėl vertinant šios grupės medžiagas į tai reikėtų atsižvelgti.

1.4. Šis 28 dienų uždelsto neurotoksiškumo tyrimas rodo kylančią riziką sveikatai, gaunant medžiagą pakartotinai per tam tikrą laiko tarpą. Šis tyrimas rodys reakciją į dozę bei įvertins nepastebimą neigiamą poveikio lygį, reikalingą nustatant medžiagos saugumo kriterijus. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

2. Apibrėžimai

3. Bandymo metodo principas. Naminėms vištoms per virškinimo traktą 28 dienas kasdien duodama tiriamoji medžiaga. Medžiagos davimo periodu ir praėjus 14 dienų po to, rečiausiai vieną kartą per dieną stebimi jų elgesio nukrypimai, ataksija ir paralyžius. Paprastai praėjus 24 ir 48 valandoms po paskutinio dozavimo, atsitiktiniu atrankos būdu iš kiekvienos grupės vištoms atliekami biocheminiai tyrimai, t. y. nustatomas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimas. Praėjus dviems savaitėms po paskutinės dozės, likusios vištos humaniškai numarinamos ir tam tikri nervų audiniai ištiriami histopatologiškai.

4. Bandymo metodo aprašymas

4.1. Pasiruošimas. Sveikos jaunos suaugusios vištos, nesirgusios virusinėmis ligomis ir negydytos, neturinčios eisenos pakitimų, atsitiktinės atrankos principu paskirstomos į tiriamąsias ir kontrolinę grupes ir mažiausiai 5 dienas iki tyrimo aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Reikia jas laikyti gana dideliuose narvuose arba aptvaruose, kuriuose vištos galėtų laisvai judėti ir būtų galima stebėti jų eiseną.

4.2. Tiriamoji medžiaga kasdien septynias dienas savaitėje dozuojama per virškinamąjį traktą, naudojant zondą arba želatinines kapsules. Skysčiai gali būti leidžiami neskiesti arba ištirpinti tirpiklyje tokiame, kaip kukurūzų aliejus. Didelės dozės kietųjų medžiagų želatininėse kapsulėse gali būti neefektyviai absorbuojamos, jas reikėtų ištirpinti. Naudojamo tirpiklio (ne vandens) toksinės savybės turi būti žinomos, o jeigu nežinomos, tai prieš tyrimą jos turi būti nustatytos.

5. Bandymo sąlygos

5.1. Tiriamieji gyvūnai. Rekomenduojamos 8–12 mėnesių amžiaus standartinio dydžio, linijos ir naminės veislės vištos (Gallus gallus domesticus), dedančios kiaušinius. Vištos turi būti užaugintos sąlygomis, leidžiančiomis joms laisvai judėti.

5.2. Skaičius ir lytis

5.2.1. Reikia sudaryti mažiausiai tris tiriamąsias grupes bei vieną tirpiklio kontrolinę grupę. Su tirpiklio kontrolinės grupės gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat kaip ir su tiriamaisiais gyvūnais, išskyrus tai, kad jie negautų tiriamosios medžiagos.

5.2.2. Kiekvienoje paukščių grupėje reikia panaudoti tiek vištų, kad mažiausiai šešias galima būtų humaniškai numarinti (po tris, praėjus dviems skirtingiems laiko tarpams) biocheminiams tyrimams ir kad praėjus 14 dienų po paskutinio dozavimo patologiniams tyrimams išgyventų dar šešios vištos.

5.3. Dozių lygiai. Dozės lygius reikia parinkti atsižvelgiant į uždelsto neurotoksiškumo ūmaus tyrimo tris rezultatus arba į jau turimus tiriamosios medžiagos toksiškumo ar kinetinius duomenis. Pasirinktas aukščiausias dozės lygis turi sukelti toksinius poveikius, geriausiai uždelstą neurotoksiškumą, tačiau turi nesukelti gyvūno žūties ar nepakeliamų kančių. Sekantys mažėjančia tvarka einantys dozių lygiai turi sukelti atitinkamai mažesnius pokyčius (atsakus), o mažiausias dozės lygis turėtų nesukelti pastebimų neigiamų poveikių.

5.4. Ribinis bandymas

5.4.1. Jeigu tirtas dozės lygis, ne žemesnis kaip 1 000 mg/kg kūno masės/d nesukelia pastebimų toksinių poveikių ir jeigu iš turimų duomenų apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, didesnių dozių tyrimai nebūtini.

5.4.2. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia naudoti didesnes dozes.

5.5. Stebėjimo periodas. Visi paukščiai stebimi mažiausiai vieną kartą per dieną visą medžiagos dozavimo periodą ir 14 dienų po to, iki atliekamas skrodimas.

5.6. Darbo eiga

5.6.1. Paukščiams tiriamoji medžiaga duodama 28 dienas kasdien septynias dienas per savaitę.

5.6.2. Bendrasis stebėjimas. Stebėti reikia tuoj pat po medžiagos davimo. 28 dozavimo dienas ir 14 dienų po to visos vištos atidžiai stebimos mažiausiai vieną kartą per dieną, po to jos humaniškai numarinamos. Visi toksiškumo požymiai turi būti registruojami, žymint jų pradžią, tipą, sunkumo laipsnį ir elgesio nukrypimų trukmę. Nereikėtų apsiriboti elgesio nukrypimų stebėjimais. Ataksiją reikėtų vertinti mažiausiai pagal keturių lygių skalę, reikėtų žymėti paralyžių. Norint pastebėti minimalų toksinį poveikį, vištos mažiausiai du kartus per savaitę išimamos iš narvų ir stebimas jų aktyvumas, priverčiant judėti, pvz., kopėčiomis. Dvesiantys ir patiriantys dideles kančias bei skausmą paukščiai išimami iš narvų, pažymimi, humaniškai numarinami ir skrodžiami.

5.6.3. Kūno masė. Prieš tiriamosios medžiagos davimą visas vištas reikia pasverti, vėliau mažiausiai vieną kartą per savaitę.

5.6.4. Biochemija

5.6.4.1. Atsitiktinės atrankos būdu šešios vištos iš kiekvienos tiriamosios ir tirpiklio kontrolinių grupių, praėjus kelioms dienoms po paskutinės dozės, humaniškai numarinamos, išimamos galvos smegenys ir juosmens dalies nugaros smegenys bei ištiriamas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimo aktyvumas. Kartais naudinga ištirti sėdimojo nervo audinio neuropatijos sukeltą esterazės slopinimo aktyvumą. Paprastai, praėjus 24 valandoms po paskutinės dozės, humaniškai numarinami trys kontrolinės ir trys kiekvienos tiriamosios grupės paukščiai, o praėjus 48 valandoms, dar po tris. Jeigu ūmaus arba kitų tyrimų (pvz. toksikokinetinių) duomenys rodo, kad po paskutinės dozės geriau pasirinkti kitą numarinimo laiką, negu siūloma, tai reikia raštiškai pagrįsti.

5.6.4.2. Taip pat galima tirti acetilcholinesterazę (AChE). Tačiau gali įvykti spontaninė AChE reaktyvacija in vivo, o tai gali nulemti nepakankamą medžiagos, kaip AChE inhibitoriaus, įvertinimą.

5.6.5. Bendrasis skrodimas. Bendrojo skrodimo metu reikia apžiūrėti visų gyvūnų galvos bei nugaros smegenų išvaizdą.

5.6.5.1. Histopatologinis ištyrimas. Išgyvenusių visą stebėjimo periodą ir nepanaudotų biocheminiams tyrimams paukščių nervų audiniai turi būti mikroskopiškai ištirti. Audiniai turi būti fiksuojami in situ, naudojant perfuzijos techniką. Įtraukiama smegenėlių (vidurinįjį-pailgąjį lygį), pailgųjų smegenų, nugaros smegenų ir periferinių nervų dalis. Iš viršutinio kaklo segmento, vidurinės-krūtininės ir juosmens-kryžmens dalių paimamos nugaros smegenų atkarpos. Paimamos blauzdikaulio nervo distalinės ir jo atšakų į skrandžio raumenį bei sėdimojo nervo atkarpos. Šias atkarpas reikia dažyti būdingais mielinui ir specifiniais aksonui dažais. Pradžioje reikia mikroskopiškai ištirti visų kontrolinės ir didžiausios dozės grupių paukščių fiksuotus audinius. Jeigu didžiausios dozės grupėje nustatomi pakitimai, galima mikroskopiškai tirti viduriniosios ir mažiausios dozės grupių paukščių audinius.

II. DUOMENYS

6. Pasirinktų metodų (biochemijos, histopatologijos ir elgesio stebėjimo) požiūriu gauti neigiami rezultatai paprastai nereikalauja uždelsto neurotoksiškumo tyrimo tęsimo. Tik šiuo požiūriu dviprasmiai arba negalutiniai rezultatai gali reikalauti tolesnio įvertinimo.

8. Gautus duomenis reikia vertinti pagal pakitimų pasireiškimą ir sunkumo laipsnį bei nustatant koreliacinius ryšius tarp elgesio, biochemijos ir histopatologinių pakitimų bei visų kitų pastebėtų pakitimų tiriamosiose ir kontrolinėje grupėse.

9. Skaitmeniniai rezultatai turi būti apdoroti tinkamais ir priimtinais statistiniais metodais. Statistiniai metodai turėtų būti pasirinkti planuojant tyrimą.

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

10. Bandymo protokolas. Bandymo protokole, jeigu įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:

10.1. Tiriamieji gyvūnai

10.1.1. Panaudotos linijos.

10.1.2. Skaičius ir amžius.

10.1.3. Gavimo šaltinis, laikymo sąlygos ir kt.

10.1.4. Kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje.

10.2. Tyrimo sąlygos.

10.2.1. Informacija apie tiriamosios medžiagos paruošimą, pastovumą ir homogeniškumą, jei to reikalaujama.

10.2.2. Tirpiklio pasirinkimo pagrindimas.

10.2.3. Informacija apie poveikį tiriamąja medžiaga.

10.2.4. Informacija apie pašarų ir vandens kokybę.

10.2.5. Dozės pasirinkimo pagrindimas.

10.2.6. Duotų dozių detalizavimas, taip pat naudotas tirpiklis, jo tūris ir medžiagos fizikinė būklė.

10.2.7. Pagrindimas, pasirinkus biocheminiams tyrimams kitą laiką (ne po 24 ir 48 valandų).

10.3. Duomenys.

10.3.1. Kūno masės duomenys.

10.3.2. Duomenys apie toksinį atsaką pagal dozės lygį ir žuvimai.

10.3.3. Nepastebimas neigiamas poveikio lygis.

10.3.4. Klinikiniai pokyčiai, sunkumo laipsnis ir trukmė (grįžtamieji ir negrįžtamieji).

10.3.5. Smulkus biocheminių metodų ir gautų duomenų aprašymas.

10.3.6. Skrodimo duomenys.

10.3.7. Smulkus visų gautų histopatologinių duomenų aprašymas.

10.3.8. Statistinis duomenų apdorojimas ten, kur tinka.

11. Duomenų aptarimas.

12. Išvados.

IV. NUORODOS

13. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade.

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B40 METODAS: ODOS SUARDYMAS

I. Bendrosios nuostatos

1. Įvadas. Europos Komisijos Generalinio direktorato Jungtinio tyrimų centro Europos alternatyvių tyrimo metodų patvirtinimo centras (ECVAM) patvirtino, kad du in vitro bandymo metodai odos suardymui įvertinti - žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos (TEV) nustatymas ir bandymas naudojant žmogaus odos modelį yra moksliškai patikimi. ECVAM atliktas patikrinamasis bandymas patvirtino, kad šiais metodais galima patikimai atskirti odą suardančias chemines medžiagas ir odos nesuardančias chemines medžiagas. Be to, bandymas naudojant žmogaus odos modelį įgalino teisingai nustatyti odos suardymo laipsnį (R35 – medžiagos, visiškai suardančios odą, ir R34 – kitos medžiagos, suardančios odą). Pateikiami abiejų metodų aprašymai bei procedūros. Šių metodų pasirinkimas priklauso nuo užsakovo poreikių. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

2. Apibrėžimai

2.1. Odos suardymas – negrįžtamas odos audinių suardymas tiriamąja chemine medžiaga.

2.2. Kiti šiame metode vartojamų sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

3. Pamatinės medžiagos. Pamatinės medžiagos nurodytos šio metodo 4.2.3.4 ir 4.4.2.3 punktuose.

4. Bandymo metodo principas

4.1. Žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos nustatymas. Tiriamosios medžiagos inkubuojamos 24 valandas ant odos diskų, paimtų iš humaniškai numarintų jaunų žiurkių odos epidermio paviršiaus. Odą suardančiosios medžiagos nustatomos pagal jų savybę suardyti odos raginio sluoksnio (stratum corneum) vientisumą bei pažeisti barjerinę jo funkciją, kuri nustatoma odos transepitelinės elektrinės varžos sumažėjimu žemiau slenkstinio lygio (5 kW). Odą dirginančios ir nedirginančios medžiagos nesumažina transepitelinės elektrinės varžos žemiau slenkstinio lygio. Tiriant paviršiaus įtemptį didinančius cheminius junginius bei organines chemines medžiagas, kurių pH yra neutralus, tyrimo metu papildomai analizuojamas šių medžiagų susirišimas su dažikliais. Tai daroma siekiant gauti mažiau klaidingų teigiamų duomenų, kurie paprastai gaunami tiriant tokias medžiagas.

4.2. Bandymo metodo aprašymas

4.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai. Odos diskai paimami iš jaunų (20–23 dienų amžiaus) Wistar ar panašaus inbrydinio kamieno žiurkių. Nugaros ir šonų vilna nukerpama žirklėmis, skirtomis gyvūnams kirpti. Po to gyvūnai gerai apiplaunami panardinus į antibiotikų (pvz., streptomicino, penicilino, chloramfenikolio ar amfotericino) bakteriostatinės koncentracijos tirpalą. 3 ar 4 dieną po pirmojo apiplovimo gyvūnai dar kartą apiplaunami antibiotikų tirpalu ir panaudojami ne vėliau kaip per 3 dienas (ruošiant odos preparatus, gyvūnai ne vyresni kaip 28 dienų).

4.2.2. Odos diskų paruošimas. Gyvūnai humaniškai numarinami. Po to atskiriama kiekvieno gyvūno oda, nuo jos atsargiai nuskutami pertekliniai riebalai. Oda uždedama ant mėgintuvėlio su politetrafluoretilenu (PTFE) galo, kad odos epidermis liestųsi su mėgintuvėlio paviršiumi. Ant mėgintuvėlio galo tvirtai užmaunamas guminis žiedas, prilaikantis odą, o nereikalingas odos likutis nukerpamas. Mėgintuvėlio ir žiedo matmenys pateikti šio metodo 1 piešinyje. Po to guminis žiedas, suteptas vazelinu, rūpestingai pritvirtinamas prie mėgintuvėlio su PTFE galo. Spyruokliniu gnybtu mėgintuvėlis įtvirtinamas recepcinėje kameroje, pripildytoje 154 mM magnio sulfato tirpalo (2 piešinys).

4.2.3. Bandymo procedūra

4.2.3.1. Tiriamosios cheminės medžiagos panaudojimas. Skystos tiriamosios cheminės medžiagos 150 ml užpilama ant odos epidermio paviršiaus, esančio mėgintuvėlyje (žiūrėti šio metodo 2 piešinį). Tiriant kietas chemines medžiagas, reikiamas kiekis užpilamas ant odos disko ir padengiamas visas epidermio paviršius. Po to ant medžiagos užpilama 150 ml dejonizuoto vandens ir mėgintuvėlis švelniai pakratomas. Tiriamosios medžiagos ir odos sąlytis turi būti kaip galima didesnis. Naudojant kai kurias kietas medžiagas tai pasiekiama pašildant mėgintuvėlį iki 30 °C, kad cheminė medžiaga ištirptų, arba ji susmulkinama į granules ar smulkius miltelius. Kiekvienai tiriamajai medžiagai naudojami 3 odos diskai. Tiriamosios medžiagos inkubuojamos 24 valandas (žiūrėti šio metodo 4.1 punktą). Tiriamoji medžiaga pašalinama, plaunant 30°C temperatūros vandens srove tol, kol jos nebelieka. Sukietėjusios tiriamosios cheminės medžiagos iš mėgintuvėlio pašalinamos 30 °C temperatūros vandens srove.

4.2.3.2. Transepitelinės elektrinės varžos matavimas

4.2.3.2.1. TEV matuojama mažos įtampos kintamosios srovės analizatoriumi (pvz., AIM 401, 6401 arba ekvivalentiškais). Prieš matuojant TEV, odos paviršiaus įtemptis sumažinama, reikiamu 70 % etilo alkoholio kiekiu padengiant visą epitelio paviršių. Po kelių sekundžių 70 % etilo alkoholis pašalinamas, apverčiant mėgintuvėlį, o odos paviršius sudrėkinamas magnio sulfato 154 mM tirpalu. Matuojant odos disko transepitelinę elektrinę varžą, kΩ, iš abiejų odos disko pusių uždedami analizatoriaus elektrodai (žiūrėti šio metodo 2 piešinį). Elektrodų matmenys ir jų ilgis žemiau spyruoklinių gnybtų parodyti šio metodo 1 piešinyje. Matuojant TEV, vidinis (storasis) elektrodo gnybtas uždedamas ant PTFE pripildyto mėgintuvėlio viršaus, kad į magnio sulfato tirpalą būtų galima panardinti reikiamą elektrodo dalį. Išorinis (plonasis) elektrodas įdedamas į recepcinės kameros dugną. Išlaikomas pastovus atstumas tarp spyruoklinio gnybto apačios ir pripildyto PTFE mėgintuvėlio (1 piešinys), kadangi nuo šio atstumo priklauso TEV.

4.2.3.2.2. Jei matuojama TEV yra didesnė nei 20 kΩ, tiriamoji cheminė medžiaga yra padengusi odos disko epidermį. Ji pašalinama, pvz., pirštine apmautos rankos nykščiu užspaudus PTFE mėgintuvėlį ir jį pakračius apie 10 sekundžių, po to magnio sulfato tirpalą išpylus ir TEV matavimus pakartojus su nauju magnio sulfato tirpalu. Transepitelinės elektrinės varžos matavimų metu gautų duomenų vidurkiai laikomi priimtinais, jei gautos vienalaikės teigiamos ir neigiamos kontrolinės vertės neviršija metode nurodytų leistinų dydžių. Žemiau pateikiamos Siūlomos kontrolinės medžiagos ir priimtini jų elektrinės varžos svyravimo intervalai, taikant aprašytą metodą ir prietaisus, pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. Kontrolinės medžiagos ir priimtini jų elektrinės varžos svyravimo intervalai

Kontrolė

Medžiaga

Leistinas elektrinės varžos intervalas (kΩ)

Teigiama

Neigiama

10 M HCl (36 %)

Distiliuotas vanduo

0,5-1,0

10-25

4.2.3.3. Modifikuota paviršiaus įtemptį didinančių medžiagų ir neutralaus pH organinių junginių tyrimo metodika. Jei tiriamųjų cheminių medžiagų paviršiaus įtemptį didinančių medžiagų ar neutralaus pH organinių junginių transepitelinė elektrinė varža yra lygi 5 kΩ arba mažesnė, tokiu atveju galima tirti dažų skvarbą į audinius.

4.2.3.3.1. Sulforodamino B dažiklio panaudojimas ir pašalinimas. Po pirminio apdorojimo tiriamąja chemine medžiaga ant kiekvieno odos disko epidermio paviršiaus užpilama 150 ml 10 % sulforodamino B dažiklio ir distiliuoto vandens tirpalo ir palaikoma 2 valandas. Po to odos diskai 10 sekundžių plaunami kambario temperatūros vandentiekio vandeniu ir pašalinamas dažiklio perteklius ar neįsiskverbęs dažiklis. Kiekvienas odos diskas atsargiai išimamas iš PTFE mėgintuvėlio su PTFE ir įdedamas į indą (pavyzdžiui, į 20 ml scintiliacinį indą) su 8 ml dejonizuoto vandens. Dažiklio pertekliui ar neįsiskverbusiam dažikliui pašalinti indai 5 minutes švelniai kratomi. Pakartojus plovimo procedūrą, odos diskai perkeliami į indus su 5 ml 30 % natrio dodecilsulfato ir distiliuoto vandens tirpalu ir inkubuojami nakčiai 60°C temperatūroje. Po inkubacijos kiekvienas odos diskas išimamas, o likęs tirpalas centrifuguojamas 8 min. 21 °C temperatūroje (santykinė centrifuginė jėga @175). 1 ml supernatanto atskiedžiama santykiu 1:5 (t. y. 1 ml + 4 ml) 30 % natrio dodecilsulfato ir distiliuoto vandens tirpalu. Tirpalo optinis tankis (OT) išmatuojamas, esant apie 565 nm bangos ilgiui.

4.2.3.3.2. Dažiklio kiekio apskaičiavimas. Sulforodamino B dažiklio kiekis, esantis viename odos diske, apskaičiuojamas pagal optinio tankio (OT) vertes (sulforodamino B dažiklio molinės ekstinkcijos koeficientas, esant bangos ilgiui 565 nm - 8,7´10⁴, molekulinė masė - 580). Kiekviename odos diske nustatomas sulforodamino B dažiklio kiekis, po to kartojant apskaičiuojamas dažiklio kiekio vidurkis. Dažiklio skvarbos duomenų vidurkiai laikomi priimtinais, jei vienalaikės kontrolinės vertės neperžengia metodo nustatytų ribų. Siūlomi priimtini dažiklio kiekio kontrolinėse medžiagose svyravimo intervalai, taikant aprašytą metodiką ir prietaisus, pateikti 2 lentelėje.

2 lentelė. Dažiklio kiekio kontrolinėse medžiagose svyravimo intervalai

Kontrolė

Medžiaga

Dažiklio kiekio intervalas mg

Teigiama

Neigiama

10 M HCl (36 %)

Distiliuotas vanduo

40-100

15-35

4.2.3.4. Papildoma informacija

4.2.3.4.1. Kai norima nustatyti visiškai odą suardančias chemines medžiagas, tiriamosios cheminės medžiagos panaudojamos odos diskams trumpą periodą (pavyzdžiui, 2 valandas). Tačiau atliekant patvirtinantį tyrimą gauti duomenys rodo, kad transepitelinės elektrinės varžos nustatymo metodu tiriant keletą cheminių medžiagų, po jų panaudojimo odos diskams 2 valandas, šių medžiagų sugebėjimas suardyti odą buvo pernelyg pervertintas, nors šis metodas leido teisingai nustatyti odą suardančias ir nesuardančias chemines medžiagas po 24 valandas trukusio bandymo.

4.2.3.4.2. Panaudoto prietaiso savybės ir matmenys bei taikyta eksperimentinė procedūra turi įtakos transepitelinės elektrinės varžos matavimo metu gaunamiems duomenims. Medžiagų, suardančių odos audinį, elektrinės varžos aukščiausia riba, lygi 5 kW, gauta panaudojus specialų prietaisą bei šiame metode aprašytą procedūrą. Tyrimo sąlygoms kardinaliai pakitus, tinka skirtingos ribinė ir kontrolinė vertės. Tiriant etalonines pasirinktas chemines medžiagas, naudojamas atliekant patikrinamąjį bandymą, rekomenduojama ribinę vertę pasirinkti pagal metodiką.

4.3. Bandymo metodo naudojant žmogaus odos modelį principas. Tiriama medžiaga iki 4 valandų laikoma ant trimačio žmogaus odos modelio, kurį sudaro rekonstruotas epidermis, turintis funkcinį raginį sluoksnį (stratum corneum). Medžiagos, suardančios odą, identifikuojamos pagal jų sugebėjimą sumažinti ląstelių gyvybingumą (pavyzdžiui, panaudojant MTT metodą) žemiau nurodytų ribinių lygių per nustatytą inkubavimo trukmę. Šis metodas patvirtina hipotezę, kad odą suardančios cheminės medžiagos yra tos, kurios sugeba prasiskverbti pro raginį sluoksnį (difuzijos ar erozijos būdu) ir yra pakankamai citotoksiškos bei sunaikina apatinių sluoksnių ląsteles.

4.4. Bandymo metodo naudojant žmogaus odos modelį aprašymas

4.4.1. Žmogaus odos modelis

4.4.1.1. Žmogaus odos modelis turi atitikti tam tikrus kriterijus. Modelis turi turėti funkcinį raginį sluoksnį, po kuriuo yra gyvų ląstelių sluoksnis. Turi būti reikiama barjerinė raginio sluoksnio funkcija. Tai parodoma demonstruojant modelio atsparumą citotoksiškumui, panaudojant ląsteles sunaikinančias chemines medžiagas, kurios normaliomis sąlygomis neprasiskverbia pro odos raginį sluoksnį. Esant nustatytoms eksperimentinėms sąlygoms, naudojant pasirinktą modelį įmanoma pakartoti rezultatus.

4.4.1.2. Modelyje esančių ląstelių gyvybingumas turi būti gana didelis, kad būtų galima atskirti teigiamas ir neigiamas kontrolines medžiagas. Ląstelių gyvybingumas (pavyzdžiui, įvertinamas pagal MTT kiekio sumažėjimą, matuojant optinį tankį) po inkubacijos su neigiama kontroline chemine medžiaga turi atitikti priimtinas konkrečiam modeliui ribas. Po inkubacijos su teigiamomis kontrolinėmis medžiagomis, lyginant jas su neigiamomis kontrolinėmis medžiagomis, ląstelių gyvybingumo laipsnis turi neviršyti nustatyto lygio. Svarbiausia įrodyti, kad panaudotas spėjimų modelis atitinka tarptautinį patvirtinimo standartą.

4.4.2. Bandymo procedūra

4.4.2.1. Tiriamosios cheminės medžiagos panaudojimas. Jei tiriamosios cheminės medžiagos yra skystos, jos naudojamos taip, kad padengtų odos paviršių (mažiausiai - 25 ml/cm²). Jei tiriamoji cheminė medžiaga yra kieta, ji naudojama taip, kad padengtų odą, po to ji sudrėkinama, kad kuo glaudžiau liestųsi su oda; jei reikia, prieš panaudojant kietos medžiagos susmulkinamos į miltelius. Pasibaigus cheminės medžiagos veikimo laikui, tiriamoji cheminė medžiaga kruopščiai nuplaunama nuo odos druskos tirpalu.

4.4.2.2. Ląstelių gyvybingumo matavimas

4.4.2.2.1. Ląstelių gyvybingumui įvertinti taikomas bet kuris kokybinis patvirtintas metodas. Dažniausiai yra taikomas MTT redukcijos metodas, pagal kurį įvairios laboratorijos gauna tikslius ir atkartojamus rezultatus.

4.4.2.2.2. Odos diskas pamerkiamas į MTT tirpalą (0,3 mg/ml) 3 valandoms, esant 20-28 °C temperatūrai). Ekstrahuojamas (tirpikliais) nusėdęs netirpus mėlynos spalvos formazanas ir nustatoma jo koncentracija, matuojant jo optinį tankį, bangos ilgiui esant tarp 545 nm ir 595 nm.

4.4.2.3. Papildoma informacija. Panaudotas odos modelis, tiksli medžiagos veikimo trukmė ir plovimo procedūros turi didžiausią įtaką ląstelių gyvybingumo matavimo rezultatams. Labai svarbu, kad šį metodą galima pakartoti daugelyje laboratorijų, panaudojant daug įvairių cheminių medžiagų. Šis metodas turi atitikti mokslinio patvirtinimo kriterijus, o patvirtinimo tyrimo duomenys privalo būti specialistų recenzuoti ir paskelbti moksliniame žurnale.

II. Duomenys

5. Rezultatų apdorojimas

5.1. Žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos nustatymo metodas. Tiriamosios cheminės medžiagos transepitelinės varžos dydžiai (kW), teigiamos bei neigiamos kontrolės ir bet kokios standartinės etaloninės cheminės medžiagos pateikiamos lentelėse, jose pateikiami ir kartojamų mėginių (pakartotinių eksperimentų) duomenys, vidurkiai bei nustatyta klasifikacija.

5.1.2. Žmogaus odos modelio tyrimas. Optinio tankio tiriamąja chemine medžiaga bei teigiamomis ir neigiamomis kontrolėmis paveiktų ląstelių gyvybingumo duomenys (%) ir bet kokios etaloninės cheminės medžiagos pateikiamos lentelėse, jose pateikiami ir kartojamų mėginių (pakartotinių eksperimentų) duomenys, vidurkiai bei nustatyta klasifikacija.

5.2. Įvertinimas ir rezultatų interpretavimas

5.2.1. Žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos nustatymo metodas

5.2.1.1. Jei tiriamosios cheminės medžiagos transepitelinės elektrinės varžos vidurkis yra didesnis nei 5 kW, ji laikoma odos audinį nesuardančia chemine medžiaga. Jei transepitelinės elektrinės varžos vidurkis yra mažesnis arba lygus 5 kW, o tiriamoji cheminė medžiaga priklauso paviršiaus įtemptį didinančioms arba neutraliu pH pasižyminčioms organinėms cheminėms medžiagoms, ji laikoma odos audinį suardančiąja chemine medžiaga.

5.2.1.2. Su paviršiaus įtemptį didinančiomis ir neutraliu pH pasižyminčiomis organinėmis cheminėmis medžiagomis, kurių transepitelinė elektrinė varža yra mažesnė arba lygi 5 kW, galima atlikti dažiklio įsiskverbimo tyrimą. Jeigu dažiklio, įsiskverbusio į odos diską, vidutinis kiekis yra didesnis arba lygus tuo pat metu gautam vidutiniam dažiklio, įsiskverbusio į odos diską, paveiktą 36 % HCl teigiama kontrole, kiekiui, tai tiriamoji cheminė medžiaga priklauso odą suardančioms medžiagoms. Jei dažiklio, įsiskverbusio į odos diską, vidutinis kiekis yra mažesnis nei tuo pat metu gauto dažiklio, įsiskverbusio į odos diską, paveikto 36 % HCl teigiama kontrole, kiekiui, tai tiriamoji medžiaga laikoma netikra teigiamąja ir priskiriama odos nesuardančioms cheminėms medžiagoms.

5.2.2. Žmogaus odos modelio tyrimas. Neigiamos kontrolės optinio tankio vertė atspindi šimtaprocentinį ląstelių gyvybingumą, taigi kiekvieno tiriamojo mėginio optinio tankio vertės panaudojamos apskaičiuojant gyvybingumo, palyginti su neigiama kontrole, procentais išreikštą vertę. Galutinė ląstelių gyvybingumo vertė, išreikšta procentais, skirianti odą suardančias chemines medžiagas nuo nesuardančių medžiagų (arba atskirianti vieną nuo kitos skirtingoms klasėms priklausančias odą suardančias chemines medžiagas), turi būti aiškiai apibūdinta spėjimo modelyje prieš patvirtinant metodą, o tolesnis patvirtinantis tyrimas turi įrodyti, kad ši galutinė riba yra tinkama.

III. Ataskaitos pateikimas

6. Bandymo protokolas. Jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:

6.1. Tiriamoji medžiaga:

6.1.1. identifikacijos duomenys, fizinė prigimtis ir, jei būtina, jos fizikinės ir cheminės savybės;

6.1.2. panaši informacija pateikiama, jei naudojamos etaloninės cheminės medžiagos.

6.2. Bandymo sąlygos:

6.2.1. taikytos procedūros aprašymas;

6.2.2. bet kokios modifikacijos aprašymas ir pagrindimas.

6.3. Rezultatai:

6.3.1. lentelėse pateikiami tiriamosios cheminės medžiagos, teigiamų bei neigiamų kontrolinių medžiagų ir bet kokių nurodytų standartinių etaloninių medžiagų varžų dydžiai (transepitelinės elektrinės varžos nustatymo metodas) arba ląstelių gyvybingumo, išreikšto procentais, dydžiai (žmogaus odos modelio tyrimas), kartu pateikiant pakartotinių mėginių (kartotinių eksperimentų) duomenis bei vidurkius;

6.3.2. bet koks kito pastebėto poveikio aprašymas.

6.4. Rezultatų aptarimas.

6.5. Išvados.

IV. Nuorodos

7. ECVAM (1998). ECVAM naujienos ir apžvalga. ATLA 26, p.275–280.

8. Fentem, J. H.., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H-G. ir Liebsch, M. (1998). Odos suardymo bandymo studijų ECVAM tarptautinis įteisinimas. 2. Vadybos komandos rezultatų įvertinimas. Toksikologija in vitro 12, p.483-524.

9. Barrat, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, L., Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998). Odos suardymo in vitro bandymų ECVAM tarptautinis įteisinimas. 1. Bandymo chemikalų atrinkimas ir paskirstymas. Toksikologija in vitro 121, p. 471–482.

10. Oliver, G. J. A., Pembeerton, M. A. & Rhodes, C. (1986). Odos suardymo bandymas in vitro – modifikacijos ir patvirtinimas. Maisto ir chemikalų toksikologija 24, pp. 507–512.

11. Botham, P. A., Hall, T. J., Dennett, R., McCall, J. C., Basketter, D. A., Whittle, E., Cheesman, M., Esdaile, D. J. ir Gardner, J. (1992). Odos suardymo in vitro bandymas: tarp laboratorinių tyrimų rezultatai. Toksikologija in vitro 6, p.191–194.

12. Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J. ir Liebsch, M. (1998). EBPO pasiūlyto odos suardymo bandymo strategijos įvertinimas. ATLA 26, p. 709–720.

13. Botham, P. A., Chamberlain, M.“ Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P. ir Balls, M. (1995). Galutinės studijos prieš įteisinant odos suardymo bandymą in vitro. ECVAM darbinio posėdžio 6 įteisinimas ir rekomendacijos. ATLA 23, p.219–255.

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos

sveikatos apsaugos ministro

2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508

B41 METODAS: FOTOTOKSIŠKUMAS. 3T3 NRU FOTOKSIŠKUMO IN VITRO BANDYMAS

I. Bendrosios nuostatos

1. Įvadas

1.1. Fototoksiškumas apibūdinamas kaip toksinė reakcija, atsirandanti, kai oda pirmą kartą paveikiama tam tikromis cheminėmis medžiagomis, o po to – šviesa arba kuri sukeliama panašiai – kai, sistemingai veikiama oda chemine medžiaga, ji apšvitinama.

1.2. 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimo in vitro rezultatai leidžia nustatyti tiriamos medžiagos fototoksinį aktyvumą, t. y. ar kokios nors tiriamosios medžiagos ultravioletiniais ir matomos šviesos spinduliais gali kelti pavojų.

1.3. Kadangi toksikologinio tyrimo in vitro tikslas - ištirti fototoksiškumą, odą paveikus cheminėmis medžiagomis ir šviesa, todėl šio tyrimo metu identifikuojami fototoksiški junginiai in vivo po to, kai jais sistemingai veikiama odą bei, kai jie joje pasiskirsto, o taip pat foto-dirginančias medžiagas, kurių veikimas pasireiškia joms paveikus konkrečią odos vietą.

1.4. Europos Bendrijos ir COLIPA (Europos kosmetikos gamintojų asociacija) bendro projekto, vykdyto 1992-1997 metų laikotarpiu, sukurtas bei patvirtintas 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimasnorint rasti įvairiems in vivo naudojamiems metodams patikimą alternatyvą in vitro sąlygomis. 1996 metais vykusiame EBPO (Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacija) seminare pasiūlytas pakopinis in vitro tyrimas fototoksiškumui įvertinti.

1.5. 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimu in vitro gautus duomenis palyginus su ūmiojo fototoksiškumo/fotodirglumo poveikiu žmonėms bei gyvūnams pastebėta, kad šis tyrimas leidžia prognozuoti tokį poveikį. Šiuo tyrimu nesiekiama prognozuoti kitokio pobūdžio žalingo poveikio, kuris atsiranda, kai oda vienu metu veikiama cheminėmis medžiagomis bei šviesa, pavyzdžiui, fotogenotoksiškumas, fotoalergija, fotosensibilizacija ar fotokarcinogenotoksiškumas, nors 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimo metu daugelis šiomis savybėmis pasižyminčių cheminių medžiagų reagavo teigiamai. Šis tyrimas nėra skirtas įvertinti šviesos fototoksiniam aktyvumui.

1.6. Nuoseklus cheminių medžiagų fototoksiškumo tyrimas pateikiamas šio metodo 1 piešinyje.

2. Apibrėžimai

2.1. Spindėjimas – ultravioletinės (UV) ar matomos šviesos, krentančios ant paviršiaus, intensyvumas, išreiškiamas W/m² arba mW/m².

2.2. Šviesos dozė – ultravioletinės (UV) ar matomosios šviesos, krentančios ant paviršiaus, kiekis išreiškiamas džauliais (= W x s) paviršiaus plotui, pvz., J/m², J/cm².

2.3. Ultravioletinės šviesos bangų juostos – CIE (Tarptautinės radiacijos komisijos) rekomenduojami žymėjimai:UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm), UVC (100-280 nm).

2.4. Vartojami ir kiti apibrėžimai: skiriamoji riba tarp UVA ir UVB ties 320 nm padala, todėl UVA galima padalyti į UV-A1 ir UV-A2, skiriamąją ribą nustatant ties 340 nm padala.

2.5. Ląstelių gyvybingumas – absoliutus ląstelių populiacijos aktyvumas (pavyzdžiui, vitalinio neutralaus raudonojo dažo sugėrimą į ląstelių lizosomas), kuris priklausomai nuo galutinio išmatuoto dydžio bei tyrimo programos susijęs/priklauso nuo bendro ląstelių skaičiaus ir/ar jų gyvybingumo.

2.6. Santykinis ląstelių gyvybingumas – ląstelių gyvybingumas, išreikštas palyginus su neigiamais pamatiniais mėginiais (tirpikliais), su kuriais atliekama visa tyrimo procedūra (arba + UV arba - UV), tačiau kurie nebuvo paveikti tiriamąja chemine medžiaga.

2.7. Spėjimų modelis – algoritmas, naudojamas toksiškumo tyrimo rezultatus paversti toksiškumo galios prognoze. Pasirinkus šį kelią, bandant spėti apie fototoksinį aktyvumą, norint 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimo in vitro metu gautus rezultatus paversti fotoksiškumo galios prognoze, galima panaudoti FSF (fotosudirginimo faktorių) bei VFE (vidutinį foto efektą).

2.8. Fotosudirginimo faktorius (FSF) – faktorius, gaunamas, lyginant tarpusavyje dvi vienodai veiksmingas tiriamas cheminės medžiagos citotoksines koncentracijas (EC₅₀) gautas, apšvitinus necitotoksine ultravioletine/matoma šviesa, nesant (- UV) ir esant (+UV).

2.9. Vidutinis fotoefektas (VFE) – naujas parametras, gautas matematiškai išanalizavus visą 2 skirtingų koncentracijų kreivių duomenis, gautus apšvitinus necitotoksine ultravioletine/matoma šviesa, nesant (- UV) ir esant (+ UV).

2.10. Fototoksiškumas – ūmiai pasireiškiantis toksinis atsakas, kai oda iš pradžių veikiama tam tikromis cheminėmis medžiagomis, o vėliau - šviesa, arba kurį sukelia į odą sistemiškai injekuojama cheminė medžiaga.

2.11. Fotosudirginimas – „fototoksiškumo“ atmaina, naudojama apibūdinti fototoksines reakcijas, kurios vyksta odoje, kai ji veikiama cheminėmis medžiagomis vietiniu ar oraliniu būdu. Vykstant šioms fototoksinėms reakcijoms, ląstelės suardomos nespecifiniu būdu (ši reakcija panaši į tą, kurią sukelia nudegimas nuo saulės).

2.12. Fotoalergija – įgytas imunologinis reaktyvumas, kurio nebūna odą veikiant chemine medžiaga pirmą kartą; jį sukelia tik 1–2 savaites trunkanti indukcija.

2.13. Fotogenotoksiškumas – genotoksinis atsakas, pažeidžiantis ląstelės genomą ir atsirandantis, kai ląstelės apšvitinamos ultravioletinės/matomos šviesos bangų negenotoksine doze ir paveikiamos negenotoksine chemine medžiaga.

2.14. Fotokancerogeniškumas – kancerogeniškas, sukeliamas pakartotinai paveikus chemine medžiaga ir šviesa. Terminas „fotokarcinogenezė“ naudojamas, kai cheminė medžiaga sustiprina ultravioletinio spinduliavimo sukelto vėžio vystymąsi.

3. Kontrolinės medžiagos. Atliekant tyrimą, norint nustatyti 3T3 NRU fototoksiškumą, šalia teigiamos kontrolinės medžiagos - chlorpromazino, kuri tiriama kiekvieno naujo bandymo metu, vienu metu naudojama grupė kontrolinių cheminių medžiagų, kurios naudojamos, atliekant šį tyrimą keliose skirtingose laboratorijose.

4. Parengtinis aptarimas. Nustatyta, kad daugelio tipų cheminės medžiagos sukelia fototoksinį poveikį. Vienintelė bendra šių medžiagų ypatybė - sugebėjimas absorbuoti saulės šviesos bangų spektre esančią šviesos energiją. Pagal I fotochemijos dėsnį (Grotthaus-Draper dėsnis) tam, kad vyktų fotocheminė reakcija, yra reikalingas pakankamas absorbuotų šviesos kvantų kiekis. Prieš atliekant biologinį tyrimą, vadovaujantis šia tyrimo metodika (pagal EBPO fototoksiškumo tyrimo rekomendaciją Nr. 101), nustatomas tiriamos medžiagos absorbuojamos ultravioletinės/matomosios šviesos bangų spektras. Jeigu moliarinės ekstinkcijos/absorbcijos koeficientas yra mažesnis nei 10 litrų ´ mol^-1´ cm^-1, tai tiriamoji medžiaga nepasižymi fototoksiniu aktyvumu ir ji nenaudojama atliekant in vitro 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą nei kurį nors kitą biologinį tyrimą, norint nustatyti žalingą fotocheminį poveikį.

5. Bandymo metodo principas

5.1. Nustatyti 4 mechanizmai, kaip chromoforas (cheminė medžiaga), absorbuodamas šviesą, sukelia fototoksinį atsaką. Jie visi sukelia ląstelių pažeidimus. 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimas in vitro remiasi cheminės medžiagos citotoksiškumo, medžiagą apšvitinant arba neapšvitinant necitotoksine UVA/matomos šviesos doze, palyginimu. Šio tyrimo metu citotoksiškumas išreiškiamas nuo koncentracijos priklausomu vitalinio neutralaus raudonojo dažo (NR) susigėrimo į ląstelę susilpnėjimu praėjus 24 valandoms, kai ląstelės buvo paveiktos tiriamąja chemine medžiaga bei apšvitintos.

5.2. Balb/c inbredinio pelių kamieno transformuoto fibroblastų ląstelių linija 3T3 kultivuojama 24 valandas in vitro, kad susiformuotų monosluoksniai. Po to į dvi 96 duobučių mikroplokšteles, tiriant vieną tiriamąją medžiagą, įvedamos 8 skirtingos tiriamosios medžiagos koncentracijos, ir plokštelės inkubuojamos 1 valandą. Po to viena mikroplokštelė apšvitinama necitotoksine 5J/cm² UVA/matomos šviesos doze (+ UV eksperimentas), o kita plokštelė tuo metu laikoma tamsoje (- UV eksperimentas). Vėliau abiejose plokštelėse esanti terpė pakeičiama kultivavimui skirta terpe, ir po pakartotinio 24 valandų inkubavimo nustatomas ląstelių gyvybingumas pagal 3 valandas trunkantį neutralaus raudonojo dažo susigėrimą (NRU) į ląsteles. Santykinis ląstelių gyvybingumas, išreiškiamas neigiamų kontrolinių mėginių (nepaveiktų nei chemine medžiaga, nei šviesa) procentais ir apskaičiuojamas kiekvienai iš 8 tiriamosios medžiagos koncentracijų. Norint prognozuoti medžiagos fototoksinį aktyvumą, lyginami atsakai į skirtingas (+ UV) ir (- UV) medžiagos koncentracijas, kai lygis būna EC₅₀, t. y. tokios koncentracijos, kuri slopina ląstelių gyvybingumą 50% tiriamąja medžiaga nepaveiktuose kontroliniuose mėginiuose.

6. Kokybės kriterijai

6.1. Ląstelių jautrumas UVA; ankstesnių tyrimų duomenys: ląstelių jautrumas UVA reguliariai tikrinamas. Ląstelės pasėjamos tokiu tankiu, kuris naudojamas, atliekant 3T3 NRU fototoksiškumą in vitro, kitą dieną ląstelės apšvitinamos UVA (1–9 J/cm²) dozėmis, o sekančią dieną ląstelių gyvybingumas nustatomas atliekant neutralaus raudonojo dažo susigėrimo į ląsteles (NRU) tyrimą. Ląstelės laikomos atitinkančios kokybės kriterijus, jei jų gyvybingumas po apšvitinimo su 5 J/cm² UVA spindulių doze sudaro ne mažiau kaip 80% tamsoje laikytų kontrolinių ląstelių gyvybingumo. Esant didžiausiai apšvitinimo UVA spinduliais dozei (9 J/cm²), ląstelių gyvybingumas sudaro ne mažiau kaip 50% tamsoje laikytų kontrolinių ląstelių gyvybingumo. Tikrinimas atliekamas, darant kas dešimtą ląstelių persėjimą.

6.2. Neigiamų pamatinių mėginių ląstelių jautrumas UVA tyrimas: tyrimas laikomas atitinkančiu kokybės kriterijus, jei neigiamų pamatinių ląstelių (laikomų Earl’o subalansuotame druskų tirpale (EBSS), kuriame yra ar nėra 1% dimetilsulfoksido (DMSO) ar 1% etiletanolio (EtOH), atliekant + UVA tyrimą, gyvybingumas sudaro ne mažiau kaip 80% neapšvitintų ląstelių, laikytų tame pačiame tirpale tamsoje (- UVA).

6.3. Neigiamų kontrolinių mėginių ląstelių gyvybingumas: absoliutus optinis tankis (OT_{540 NRU}) išmatuotas NR neigiamų kontrolinių mėginių ląstelių ekstrakte parodo, ar 1 x 10⁴ ląstelių, pasėtų į 1 mikroplokštelės duobutę, skaičius padidėjo, padvigubinus laiką per dvi tyrimo dienas. Tyrimas laikomas priimtinu, jei kontrolinių mėginių, nepaveiktų chemine medžiaga, optinio tankio (OT_{540 NRU}) vidurkis yra ³ 0,2.

6.4. Teigiami kontroliniai mėginiai: atliekant kiekvieną 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, tiriamas ir žinomos cheminės medžiagos fototoksinis aktyvumas. Europos Sąjungos/COLIPA patvirtinančiame tyrime teigiama kontroline medžiaga buvo chlorpromazinas, todėl rekomenduojama jį naudoti. Atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, naudojant chlorpromaziną pagal standartinį protokolą, nustatyti tokie tyrimo priimtinumo kriterijai: ląstelių, apšvitintas UVA chlorpromazinas: EC₅₀ = 0,1-2mg/ml, neapšvitintas UVA chlorpromazinas = nuo 7,0 iki 90,0 mg/ml. Foto dirglumo faktorius, t. y. EC₅₀ pokytis ne mažesnius negu 6.

6.5. Vietoj chlorpromazino kaip gretutinės teigiamos kontrolinės medžiagos naudojamos kitos žinomos cheminės medžiagos, pasižyminčias fototoksiniu aktyvumu bei atitinkančias tiriamos medžiagos klasę bei pasižyminčias tokiomis pat tirpumo savybėmis. Tuo atveju, kaip rodo ankstesnių tyrimų duomenys, tinkamai nustatoma EC₅₀ dydžių intervalus/skalė, fotodirglumo faktorius bei vidutinis fotoefektas kaip tyrimo priimtinumo kriterijus.

7. Bandymo metodo aprašymas

7.1. Pasiruošimas

7.1.1. Ląstelės

7.1.1.1. Atliekant patvirtinimo tyrimą, panaudota pelių fibroblastų ląstelių permanentinė linija Balb/c/3T3 (klonas 31), gauta arba iš ATCC arba iš ECACC ir todėl siūloma ją naudoti. Atliekant tyrimą pagal tą patį protokolą, galima sėkmingai panaudoti kitas ląsteles ar ląstelių linijas, jei jų kultivavimo sąlygos yra pritaikytos specifiniams ląstelių poreikius, tačiau reikia, kad jos būtų ekvivalentiškos.

7.1.1.2. Nuolat tikrinama, ar ląstelės neužkrėstos mikoplazmomis, ir tik tada, kai tokio patikrinimo rezultatai yra patenkinami, ląstelės tiriamos.

7.1.1.3. Didinant ląstelių persėjimų skaičių, ląstelių jautrumas UVA spinduliams padidėja, todėl tiriamos pačio mažiausio persėjimo (mažesnio nei 100) Balb/c/3T3 linijos ląstelės. Svarbu patikrinti Balb/c/3T3 linijos ląstelių jautrumą UVA spinduliams pagal šioje metodikoje pateiktą kokybės kontrolės procedūrą.

7.1.2. Terpė ir kultivavimo sąlygos. Atliekant įprastinį ląstelių persėjimą bei tyrimo procedūras, naudojama atitinkama terpė bei kultivavimo sąlygos. Balb/c/3T3 linijos ląstelės kultivuojamos DMEM terpėje, papildytoje 10% naujagimių veršelių serumu, 4mM glutaminu, penicilinu bei streptomicinu drėgnoje atmosferoje, kai aplinkos temperatūra siekia 37°C, o CO₂ kiekis - 7,5%. Svarbu, kad ląstelių kultivavimo sąlygos užtikrintų ląstelinį ciklą tyrime naudojamų ląstelių ar jų linijų gyvavimo laikotarpiu.

7.1.3. Kultūrų paruošimas

7.1.3.1. Ląstelės, paimtos iš užšaldytų kamieninių kultūrų, pasėjamos į kultivavimo terpę reikiamu tankumu ir bent kartą yra persėjamos prieš jas panaudojant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrime in vitro.

7.1.3.2. Ląstelės, kurios naudojamos fototoksiškumo tyrime, pasėjamos į kultivavimo terpę tokiu tankiu, kad atskiros ląstelių kolonijos nesusilietų kultivavimo pabaigoje, t. y. tada, kai praėjus 48 valandoms nuo ląstelių pasėjimo, yra įvertinamas jų gyvybingumas. Balb/c/3T3 linijos ląstelėms, auginamoms 96 duobučių mikrotitravimo plokštelėje, rekomenduojamas ląstelių tankis 1 duobutėje yra 1 x 10⁴.

7.1.3.3. Tiriant kiekvieną cheminę medžiagą, ląstelės vienodai pasėjamos į 2 atskiras 96 duobučių mikrotitravimo plokšteles, kurios viso tyrimo metu yra kultivuojamos vienodomis sąlygomis, išskyrus tą laikotarpį, kai ląstelės, kultivuojamos vienoje plokštelėje, apšvitinamos (+ UVA spinduliais/matoma šviesa), o kitoje plokštelėje - laikomos tamsoje (- UVA/matoma šviesa).

7.1.4. Metabolinė aktyvacija. Atliekant tyrimus, siekiant įvertinti tiriamų medžiagų genotoksinį bei karcinogeninį aktyvumą, naudojamos metabolinės sistemos, tačiau fototoksikologinių tyrimų atveju nėra žinoma jokia cheminė medžiaga, kurią reikia transformuoti metaboliniu būdu, norint, kad ta medžiaga veiktų kaip fototoksinas tiek in vivo, tiek in vitro. Dėl šios priežasties šiam tyrimui metabolinės aktyvacijos sistema nėra nei būtina, nei moksliškai pateisinama.

7.1.5. Tiriamoji cheminė medžiaga/preparatas

7.1.5.1. Iškart, prieš pradedant tyrimą, tiriamos cheminės medžiagos naujai paruošiamos, nebent jų stabilumo tyrimai rodo, kad laikymo metu medžiagos nepakito. Medžiagos paruošiamos apšvietus raudona šviesa, jei gali prasidėti greita jų fotodegradacija.

7.1.5.2. Tiriamos medžiagos ištirpinamos buferiniuose druskų tirpaluose - Earl’o balansuotame druskų tirpale (EBSS) arba buferiniame fosfatinių druskų tirpale (PBS), kuriuose nėra nei baltymų, nei absorbuojančių šviesą pH indikatorinių spalvų, nes švitinimo metu nebus išvengta tyrimo klaidų.

7.1.5.3. Ribotai tirpstančios vandenyje tiriamosios medžiagos maksimaliai (iki 100%) ištirpinamos atitinkamuose tirpikliuose, kad būtų pasiekta pageidaujama jų koncentracija ir tada jas galima praskiesti buferiniais druskų tirpalais santykiu 1:100. Jei naudojamas tirpiklis, visose kultūrose jo tūris turi būti pastovus -1%(v/v), t. y. neigiamuose kontroliniuose mėginiuose ir visose tiriamosios medžiagos koncentracijose.

7.1.5.4. Rekomenduojami tirpikliai yra dimetilsulfoksidas (DMSO) ir etanolis (EtOH). Galima naudoti ir kitus nedidelio citotoksiškumo tirpiklius (pvz., acetoną), tačiau prieš naudojimą detaliai ištiriamos jų specifinės savybės, pvz., jų sąveika su chemine medžiaga, fototoksinio efekto slopinimas bei laisvųjų radikalų surišimas.

7.1.5.5. Tirpumas padidinamas tiriamąją medžiagą suplakant, ir/ar suardant ultragarsu, ir/ar kaitinant iki 37°C temperatūros.

7.1.6. Švitinimas ultravioletiniais spinduliais/pasirengimas

7.1.6.1. Šviesos šaltinis: tinkamas šviesos šaltinis bei šviesos filtras yra svarbiausi faktoriai, apsprendžiantys fototoksiškumo tyrimą. UVA spindulių bei matomosios šviesos spindulių bangos ilgio spektrai dažniausiai yra susiję su fotosensibilizacija, UVB spinduliai nėra tokie svarbūs bei pasižymi dideliu tiesioginiu citotoksiškumu - bangos ilgio spektrui esant tarp 313 ir 280 nm, UVB citotoksiškumas padidėja net 1000 kartų. Parenkant tinkamą šviesos šaltinį, vadovaujamasi kriterijais, kurie reikalauja, kad žinomais fotosensibilizatoriais pasirinktu laiko periodo būtų galima užregistruoti šviesos šaltinio išspinduliuotos šviesos, kurią absorbuoja tiriamoji cheminė medžiaga, bangos ilgius ir dozę. Be to, bangos ilgiai ir dozė, įskaitant ir šilumos (infraraudonojo bangos ilgio spektre) emisiją, neturi turėti pernelyg neigiamos įtakos tiriamajai sistemai.

7.1.6.2. Optimaliausias šviesos šaltinis yra saulės šviesą mėgdžiojantys prietaisai. Juose naudojami tiek ksenoniniai, tiek ir gyvsidabriu padengti kaitinamieji lankai. Pastarieji pranašesni dėl to, kad yra pigesni ir mažiau išspinduliuoja šilumos, tačiau jų išspinduliuojama šviesa, artima saulės šviesai, nėra patenkinama. Kadangi visi prietaisai, mėgdžiojantys saulės šviesą, išspinduliuoja pakankamai didelius UVB spindulių kiekius, tai tinkamai filtruojama jų išspinduliuojama šviesa, kad būtų susilpninti UVB spinduliai, pasižymintys dideliu citotoksiškumu.

7.1.6.3. Atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, naudojamas prietaisas, kurio apšvitinimo spektras, neturintis UVB ilgio bangų (UVA/UVB santykis turi būti lygus 1:20). Atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, paskelbti duomenys apie saulės šviesą mėgdžiojančio prietaiso išspinduliuojamos šviesos bangų spektro pasiskirstymą.

7.1.6.4. Dozimetrija: prieš kiekvieną fototoksiškumo tyrimą, panaudojant tinkamą plačiabangį ultravioletinių spindulių bangų matavimo prietaisą, pastoviai tikrinamas spinduliuojamos šviesos intensyvumas. Šis matavimo prietaisas kalibruojamas šviesos šaltinio atžvilgiu. Ultravioletinių spindulių matavimo prietaisą reikia tikrinti, panaudojant kitą standartinį prietaisą, skirtą matuoti ultravioletiniams spinduliams bei priklausantį tam pačiam tipui ir kalibruotą šviesos šaltinio atžvilgiu tokiu pat būdu. Šviesos šaltinio išspinduliuotų bei praėjusių pro filtrą bangų spektras bei plačiabangis prietaisas, kalibruotas šviesos šaltinio atžvilgiu ir skirtas matuoti ultravioletiniams spinduliams turi būti atitinkamai išmatuotas bei patikrintas spektriniu radiometru, su šiuo prietaisu turi dirbti apmokyti kvalifikuoti asmenys.

7.1.6.5. Atliekant patvirtinimo tyrimą, nustatyta, kad UVA spinduliavimo intensyvumo dozė (5 J/cm²) nėra citotoksiška BALB/c/3T3 linijos ląstelių atžvilgiu bei pakankama, kad cheminės medžiagos, pasižyminčios mažu citotoksiniu aktyvumu, būtų sužadinamos. Tam, kad ši dozė būtų pasiekta per 50 minučių, spinduliavimo intensyvumas turi siekti 1,666 mW/cm². Jei naudojama kita ląstelių linija ar UVA spindulių dozė, kurią išspinduliuoja prietaisas, kalibruotas kitu būdu, tai panaudojami kriterijai, kurie neturi neigiamos įtakos ląstelėms ir yra pakankami, kad būtų galima užregistruoti standartinius fototoksinius efektus.

7.1.6.6. Šviesos spinduliavimo trukmė apskaičiuojama pagal formulę:

spinduliavimo dozė (J/cm²× 1000)

t(min) = (1 J = 1 W sek.)(1)

spinduliavimas (mW/cm²× 1000)

7.2. Bandymo sąlygos

7.2.1. Tiriamosios cheminės medžiagos maksimali koncentracija neturi viršyti 100 mg/ml, kadangi visos cheminės fototoksinės medžiagos nustatomos, kai jų koncentracija yra nedidelė, tuo tarpu, kai koncentracija didėja, tai didėja ir teigiamų klaidingų rezultatų skaičius. Kai tiriamosios cheminės medžiagos koncentracija - maksimali, tai jos pH turi atitikti pageidaujamą intervalą (6,5–7,8).

7.2.2. Tiriamosios cheminės medžiagos, apšvitintos UVA spinduliais laikomos tamsoje, koncentracijos ribos nustatomos anksčiau vykdytų ribų paieškos tyrimų metu. Koncentracijų serijų riba ir jų skiriamoji riba taip nustatomos, kad eksperimentiniai duomenys atitiktų atsakus į skirtingas tiriamosios medžiagos koncentracijas. Tam tikslui panaudojamos geometrinės koncentracijų serijos (kartu su pastovaus praskiedimo faktoriumi).

7.3. Bandymo procedūra

7.3.1. Pirmoji diena

7.3.1.1. Ląstelių suspensija paruošiama terpėje, skirtoje ląstelių kultivavimui (10⁵ ląstelių/ml) ir į periferines 96 duobučių mikrotitravimo plokštelės duobutes (taip vadinamąsias tuščiąsias arba „blank“ duobutes) išpilstoma po 100 ml terpės. Į likusias duobutes išpilstoma po 100 ml paruoštos ląstelių suspensijos (10⁵ ląst./ml arba 10⁴ ląstelių/duobutę). Kiekvienai tiriamajai medžiagai paruošiamos 2 mikrotitravimo plokštelės, kurių viena bus apšvitinama UVA spinduliais ir skirta fotoksiškumo įvertinimui, tuo tarpu kai kita bus laikoma tamsoje ir skirta citotoksiškumui nustatyti.

7.3.1.2. Ląstelės inkubuojamos 24 valandas (atmosferoje, turinčioje 7,5% CO₂, esant 24°C temperatūrai) tol, kol susidarys pusiau susiliejantis ląstelių monosluoksnis. Šios inkubacijos metu ląstelių gyvybinis ciklas atsigauna, jos prilimpa prie substrato bei prasideda eksponentinis ląstelių populiacijos skaičiaus didėjimas.

7.3.2. Antroji diena

7.3.2.1. Po inkubacijos terpė nupilama nuo ląstelių ir jos 2 kartus praplaunamos įpilant į duobutę po 150 ml EBSS/PBS tirpalo. Po praplovimo į kiekvieną duobutę įpilama po 100 ml EBSS/PBS tirpalo, turinčio atitinkamos koncentracijos tiriamosios medžiagos arba tirpiklio (neigiamosios kontrolės). Tyrimui naudojamos 8 skirtingos tiriamosios medžiagos koncentracijos. Ląstelės inkubuojamos su tiriamąja medžiaga tamsoje 1 valandai (7,5% CO_2, 37°C).

7.3.2.2. Atliekant fotoksiškumo tyrimą, ląstelės švitinamos per plokštelės dangtelį 50 minučių kambario temperatūroje 1,7 mW/cm² intensyvumo UVA spinduliais (5 J/cm²). Po to plokštelė džiovinama su džiovintuvu, kad po jos dangteliu nesikondensuotų vandens lašai. Plokštelės, kurios bus panaudotos citototoksiškumo tyrimui, laikomos tamsioje dėžėje 50 minučių kambario temperatūroje (laikymo sąlygos, adekvačios plokštelės, naudojamos fototoksiškumo tyrimams, sąlygoms).

7.3.2.3. Tiriamasis tirpalas nupilamas, ląstelės 2 kartus praplaunamos, įpilant į kiekvieną duobutę po 150 ml EBSS/PBS tirpalo. Vėliau šis tirpalas pakeičiamas terpe, skirta ląstelių kultivavimui ir plokštelė inkubuojama per naktį (7,5% CO₂, 37°C temperatūroje).

7.3.3. Trečioji diena

7.3.3.1. Mikroskopinis tyrimas. Ląstelės analizuojamos faziniu-kontrastiniu mikroskopu. Registruojami morfologiniai ląstelių pokyčiai, atsiradę dėl tiriamosios cheminės medžiagos sukeltų citotoksnių efektų. Šis patikrinimas rekomenduojamas tam, kad būtų išvengta klaidų eksperimento metu, tačiau, tiriant citotoksiškumą ar fototoksiškumą, šie užrašai nėra naudojami.

7.3.3.2. Neutralaus raudonojo (NR) dažo susigėrimo tyrimas

7.3.3.2.1. Ląstelės praplaunamos su 150 ml pašildytu EBSS/PBS tirpalu, vėliau jis atsargiai pašalinamas, nusiurbiant jį automatine mikropipete. Į kiekvieną duobutę pripilama 100 ml NR terpės ir inkubuojama 3 valandoms (7,5% CO₂, 37°C temperatūroje).

7.3.3.2.2. Po inkubacijos NR terpė nupilama, o ląstelės perplaunamos, į kiekvieną duobutę įpilant po 150 ml EBSS/PBS tirpalo. Praplovimui skirtas tirpalas nupilamas ir plokštelė visiškai išdžiovinama, centrifuguojant ją apgręžiamuoju būdu.

7.3.3.2.3. Į kiekvieną duobutę pripilama po 150 ml NR absorbcinio tirpalo (šviežiai paruošto etilo alkoholio ir acto rūgšties tirpalo).

7.3.3.2.4. Plokštelė greitai purtoma 10 minučių ant kratytuvo tol, kol NR visiškai difunduoja iš ląstelių bei susidaro homogeniškas NR tirpalas.

7.3.3.2.5. NR tirpalo optinis tankis matuojamas spektrofotometru (bangos ilgiui siekiant 540 nm), o duobutės, pripildytos tik terpės, atlieka kontrolinį vaidmenį.

Gauti duomenys yra saugomi atitinkamo formato laikmenoje (pvz., ASCII) tam, kad vėliau būtų galima juos analizuoti.

II. DUOMENYS

8. Kokybiniai ir kiekybiniai duomenys

8.1 Remiantis duomenimis, atliekama atsako, gauto apšvitinus bei neapšvitinus UVA spinduliais ir priklausomo nuo koncentracijos analizė. Jei nustatomas fototoksiškumas, tai tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijos intervalas ir atskirų jos koncentracijų susikirtimo taškai pateikiami, kad eksperimentiniai duomenys atitiktų kreivę. Tamsoje laikoma tiriamoji cheminė medžiaga gali būti necitotoksiška iki apibrėžtos koncentracijos (100 mg/ml), bet ypač citotoksiška tada, kai apšvitinama UVA spinduliais, tai abiejų eksperimento etapų metu tiriamas koncentracijos intervalas ir šitam tikslui pasiekti gali prireikti nubrėžti aiškią skiriamąją ribą tarp atskirų koncentracijos dydžių tam, kad būtų paisoma adekvačių duomenų kokybei taikomo reikalavimo. Jei abiejų eksperimento etapų (medžiagą švitinant spinduliais arba laikant ją tamsoje) citotoksiškumas nenustatomas, tai užtenka nustatyti skiriamąją ribą tarp atskirų dozių iki pačios didžiausios medžiagos koncentracijos.

8.2. Nereikalaujama pakartoti eksperimentą tam, kad būtų patvirtintas akivaizdus teigiamas rezultatas.

8.3. Nereikia patvirtinti akivaizdžiai neigiamų rezultatų, gaunamų, tiriant cheminę medžiagą, kurios koncentracija yra pakankamai didelė. Užtenka atlikti vieną pagrindinį eksperimentą bei keletą papildomų eksperimentų, kurių metu preliminariai nustatomi koncentracijų intervalai.

8.4. Tyrimai kartojami, jei, panaudojant spėjimų modelį, gaunami labai arti galutinės ribos esantys tarpiniai rezultatai.

8.5. Jei reikalinga, tai atliekant pakartotinį tyrimą, keičiamos eksperimento sąlygos, kurios turi didelės reikšmės, norint gauti pageidaujamą rezultatą. Pagrindinė šio tyrimo procedūra - tiriamosios cheminės medžiagos tirpalų paruošimas. Todėl eksperimento sąlygų pakeitimai (papildomas tirpiklis, medžiagos suardymas, sutrinant ją arba veikiant ultragarsu gali turėti reikšmės, kartojant eksperimentą. Priešingu atveju pakeičiama inkubacijos prieš apšvitinimą trukmė. Trumpesnė inkubacija svarbi greitai vandenyje suyrančioms cheminėms medžiagoms.

9. Rezultatų apdorojimas. Jei yra įmanoma, tai nustatoma tiriamosios medžiagos koncentracija, kuriai esant, ląstelinis NRU inhibuojamas 50 % (EC₅₀). Tyrimo metu gautus atsako į skirtingas koncentracijas duomenis apdorojant nelinijinės regresijos (pirmiausia - Hill funkcijos arba atitinkamos logistinės regresijos) arba kitomis atitikimo procedūromis. Prieš panaudojant EC₅₀ tolimesniems apskaičiavimams, būtina atitinkamai patikrinti atitikimo kokybę. EC₅₀ apskaičiuojamas ir grafiniais duomenų atitikimo metodais. Šiuo atveju rekomenduojama nubraižyti tikimybinį grafiką (x ašis - log; y ašis - tikimybinis vienetas arba probitas), kadangi atlikus šią transformaciją, atsako į įvairias koncentracijas funkcija taps linijinė.

10. Rezultatų įvertinimas (spėjimų modeliai)

10.1. Spėjimo modelio I versija: fotosensibilizacijos faktorius (FSF)

10.1.1. Atliekant apšvitinimo UVA spinduliais ir laikymo tamsoje eksperimentus, gaunamos atsako į skirtingas tiriamosios medžiagos koncentracijas kreivės, o FSF apskaičiuojamas pagal sekančią formulę:

FSF = (2)

10.1.2. Jei FSF<5, tai medžiaga nėra fototoksiška, tuo tarpu jei FSF>5, medžiaga - fototoksiška.

10.1.3. Jei cheminė medžiaga, apšvitinus ją ultravioletiniais spinduliais, pasirodo esanti citotoksiška, o laikant ją tamsoje - necitotoksiška, tai tokiu atveju fotosensibilizacijos faktoriaus neįmanoma apskaičiuoti. Tokiais atvejais, kai, tiriamąją medžiagą laikant tamsoje, atliekamas citotoksiškumo tyrimas ir nustatomas fotosensibilizacijos faktorius, tai šio faktoriaus vertė apskaičiuojama pagal didžiausią tiriamosios medžiagos koncentraciją (C_max):

FSF = (3)

10.1.4. Jei įmanoma apskaičiuoti FSF vertę, tai, remiantis bet kokia šio faktoriaus reikšme, didesne nei 1, bus galima spėti apie fototoksinį medžiagos aktyvumą.

10.1.5. Jei cheminei medžiagai esant pačios didžiausios koncentracijos, ji nepasižymi citotoksiškumu ir dėl to, medžiagą laikant tamsoje ar ją apšvitinus ultravioletiniais spinduliais, negalima apskaičiuoti EC₅₀ abiem atvejais, tai šitai rodo, kad medžiaga nepasižymi fototoksiškumu. Tokiais atvejais pažymima, kad išmatavus fotosensibilizacijos faktorių, jis lygus 1.

FSF = *1 (4)

10.1.6. Jei galima gauti tik FSF, lygų 1, tai šitai rodo, jog medžiaga nėra fototoksiška.

Kai b ir c atvejais bandoma spėti apie medžiagos fototoksinį aktyvumą, reikia atkreipti dėmesį į tiriamosios medžiagos koncentracijas, gautas tiriant 3T3 NRU fototoksiškumą in vitro.

10.2. Spėjimų modelio II versija: vidutinis fotoefektas (VFE). Bandant nuspėti apie medžiagos fototoksinį aktyvumą, galima taikyti ir kitą spėjimų modelio versiją, kuri buvo sukurta, kai Europos Sąjunga ir COLIPA atliko patvirtinimo tyrimą ir vėliau ištyrė cheminių medžiagų, apšvitintų filtruotais ultravioletiniais spinduliais, fototoksiškumą in vitro, esant „nulinėms sąlygoms“¹³. Taikant ši modelį, išvengiama fotosensibilizacijos faktoriaus modelio apribojimų tais atvejais, kai EC₅₀ neįmanoma apskaičiuoti. Šis modelis remiasi vidutiniu fotoefektu - parametru, kuris remiasi absoliučių atsakų į skirtingas tiriamosios medžiagos koncentracijas kreivių lyginimu. Tam, kad VFE modelis būtų pritaikytas, Berlyno Humboldt universitete buvo sukurta nemokamai įsigyjama speciali kompiuterinė programa.

11. Rezultatų interpretavimas

11.1. Teigiamas rezultatas, gautas, tiriant 3T3 NRU fotoksiškumą in vitro (FSF>5; VFE>0,1), rodo, kad tiriamoji cheminė medžiaga pasižymi fototoksiniu aktyvumu. Jei šis rezultatas buvo gautas, kai tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijos buvo mažesnės nei 10 mg/ml, tai rodo, kad ši medžiaga gali įgyti fototoksinį aktyvumą, esant įvairioms apšvitinimo sąlygoms in vivo. Jei teigiamas rezultatas gaunamas tada, kai didžiausia tiriamosios cheminės medžiagos koncentracija siekia 100 mg/ml, tai vėliau būtina įvertinti tos medžiagos keliamą žalą arba fototoksinį aktyvumą. Šitai galima atlikti, tiriant cheminės medžiagos įsiskverbimą bei kaupimąsi odos audinyje arba cheminę medžiagą tiriant kitu metodu, patvirtinančiu medžiagos fototoksiškumą (pvz., panaudojant modelinę žmogaus odos sistemą).

11.2. Neigiamas rezultatas, gautas, tiriant 3T3 NRU fototoksiškumą in vitro (FSF<5 arba VFE<0,1), rodo, kad tiriamoji cheminė medžiaga nėra fototoksiška žinduolių ląstelėms, kurios buvo kultivuojamos, esant nustatytomis sąlygomis. Kai tiriamosios cheminės medžiagos didžiausia koncentracija siekė 100 mg/ml, neigiamas rezultatas rodo, kad tiriamoji cheminė medžiaga nėra fototoksiška in vitro ir nepanašu, kad ji įgis šį aktyvumą in vivo. Tais atvejais, kai buvo naudojamos mažesnės tiriamosios medžiagos koncentracijos ir gauti identiški atsakai į fototoksinės medžiagos, apšvitintos ultravioletiniais spinduliais bei laikytos tamsoje skirtingas koncentracijas, gauti rezultatai bus vienodai interpretuojami. Kai nebus nustatytas medžiagos fototoksiškumas, apšvitinus ją ultravioletiniais spinduliais arba laikant tamsoje ir jei tiriamosios medžiagos koncentracijos, kurias apriboja jos tirpumas vandenyje, bus mažesnės nei 100 mg/ml, bus galima suabejoti metodu, kuriuo tiriama ši cheminė tiriama bei būtina atlikti patvirtinimo tyrimą (odos audinio modelinė sistema in vitro ar ex vivo arba tyrimas in vitro).

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS

12. Bandymo protokole pateikiama tokia informacija:

12.1. Tiriamoji medžiaga:

12.1.1. identifikacijos duomenys bei CAS numeris, jeigu jis žinomas;

12.1.2. fizinė prigimtis ir grynumas;

12.1.3. tyrimui svarbios fizikinės ir cheminės savybės;

12.1.4. stabilumas ir fotostabilumas, jei jie žinomi.

12.2. Tirpiklis:

12.2.1. tirpiklio pasirinkimo pagrindimas;

12.2.2. tiriamos cheminės medžiagos tirpumas šiame tirpiklyje;

12.2.3. tirpiklio kiekis terpėje (EBSS arba PBS), kuria paveikiama cheminė medžiaga.

12.3. Ląstelės:

12.3.1. ląstelių tipas ir šaltinis;

12.3.2. ar ląstelėse neaptikta mikoplazmų;

12.3.3. ląstelių persėjimų skaičius, jei jis žinomas;

12.3.4. ląstelių jautrumas ultravioletiniams spinduliams, nustatytas, atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, panaudojant apšvitinančius prietaisus.

12.4. Tyrimo sąlygos. Inkubacija prieš poveikį ir po jo:

12.4.1. terpės, skirtos kultivavimui, tipas ir sudėtis;

12.4.2. inkubacijos sąlygos (CO₂ koncentracija, temperatūra, drėgmė);

12.4.3. inkubacijos trukmė (prieš poveikį ir po jo).

12.5. Tyrimo sąlygos. Paveikimas tiriamąja chemine medžiaga:

12.5.1. pagrindimas, kodėl pasirinkta tokia apšvitinamos ultravioletiniais spinduliais ir laikomos tamsoje tiriamosios cheminės medžiagos koncentracija;

12.5.2. pagrindimas, kodėl tyrimui pasirinkta didžiausia koncentracija, kai tiriamosios medžiagos tirpumas terpėje yra ribotas ir medžiaga nėra citotoksiška;

12.5.3. terpės, kurioje buvo paveikiamas tyrimo objektas, buferinių druskų tirpalo tipas ir sudėtis,

12.5.4. poveikio tiriamąja chemine medžiaga trukmė.

12.6. Tyrimo sąlygos. Apšvita:

12.6.1. pagrindimas, kodėl pasirinktas tyrimo metu naudotas šviesos šaltinis;

12.6.2. šviesos šaltinio išspinduliuojamų bangų spektrinės charakteristikos;

12.6.3. panaudoto šviesos filtro pralaidumo/ absorbcijos charakteristikos;

12.6.4. radiometro charakteristikos bei jo kalibravimo duomenys;

12.6.5. atstumas tarp šviesos šaltinio ir tiriamosios sistemos;

12.6.6. apšvitos UVA spinduliais intensyvumas, esant nustatytam atstumui, išreikštas mW/cm²;

12.6.7. apšvitos UV/matoma šviesa trukmė;

12.6.8. UVA spindulių dozė, išreikšta J/cm²;

12.6.9. temperatūra, kuriai esant ląstelių kultūros buvo apšvitinamos bei tuo pat metu laikomų tamsoje ląstelių..

12.7. Tyrimo sąlygos. NRU tyrimas:

12.7.1. NR terpės sudėtis;

12.7.2. NR inkubacijos trukmė;

12.7.3. inkubacijos sąlygos (CO₂ koncentracija, temperatūra, drėgmė);

12.7.4. NR išskyrimo sąlygos (išskyrimui panaudota medžiaga, trukmė);

12.7.5. šviesos bangos ilgis, panaudotas spektrofotometriniam NR optinio tankio nustatymui;

12.7.6. antrasis standartinis bangos ilgis (etalonas), jei toks buvo panaudotas;

12.7.7. nulinė spektrofotometro padėtis, jeigu buvo panaudotas.

13. Rezultatai:

13.1. ląstelių gyvybingumas, nustatytas kiekvienai tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijai ir išreikštas kontroliniuose mėginiuose esančių ląstelių vidutinio gyvybingumo procentais;

13.2. atsakų į skirtingas tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijas kreivės (tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijos ir santykinio ląstelių gyvybingumo santykis), nustatytos vienu metu atlikus medžiagos + UVA ir - UVA fototoksiškumo tyrimus;

13.3. atsakų į skirtingas tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijas kreivėje pateiktų duomenų analizė; jei įmanoma, tai apskaičiuojamas medžiagos EC₅₀, (+ UVA) ir EC₅₀ (- UVA);

13.4. dviejų atsakų į medžiagos koncentracijas kreivių, gautų, nesant UVA/matomos apšvitos, palyginimas arba apskaičiuojant fotodirglumo faktorių (FDF) arba vidutinį fotoefektą (VFE);

13.5. fototoksinio aktyvumo klasifikacija;

13.6. tyrimo priimtinumo kriterijai – gretutiniai neigiami kontroliniai mėginiai:

13.6.1. absoliutus ląstelių, apšvitintų ir neapšvitintų UVA spinduliais, gyvybingumas (NR ekstrakto optinis tankis);

13.6.2. anksčiau atliktų tyrimų metu gauti duomenys apie naudotus neigiamus kontrolinius mėginius, jų vidurkis ir standartinis nukrypimas;

13.7. tyrimo priimtinumo kriterijai – gretutiniai teigiami kontroliniai mėginiai:

13.7.1. teigiamame kontroliniame mėginyje esančios cheminės medžiagos EC₅₀ (+UVA) ir spinduliais ir laikytos tamsoje, EC₅₀(-UVA) bei PIF;

13.7.2. anksčiau atliktų tyrimų duomenys apie teigiamuose kontroliniuose mėginiuose esančios cheminės medžiagos, EC₅₀(+UVA) ir EC₅₀ (-UVA), vidutinį PIF bei jo standartinį nukrypimą.

14. Rezultatų aptarimas.

15. Išvados.

IV. NUORODOS

16. Spielman H., Balls M., Döring B., Holzhünter H. G., Kalweit S., Klecak G., L'Eplattenier H., Liebsch M., Lovell W. W., Maurer, T., Moldehauer F., Moore L., Pape W., Phannbecker U., Pothast J., De Silva O., Stelling and Willshaw, A. (1994), EEC/COLIPA in vitro fototoksiškumo tyrimo projektas: fototoksiškumo tyrimo su Balb/c 3T3 ląstelėmis pirminių rezultatų pateikimas. Toxicology in Vitro 8, 793–796.

17. Anon (1998), Ataskaita apie 3T3 NRU PT tyrimo mokslinį įvertinimą (fototoksiškumo tyrimas in vitro), European Commission, Joint research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, 7–8.

18. Spielmann H., Balls M., Dupuis J., Pape W. J., Peckovitch G., De Silva O., Holzhutter H. G., Clothier R., Desolle P. Steiling W., Brantom, P.(1998), EU/COLIPA „Fototoksiškumas in vitro“: vertinimo studijos, II fazės rezultatai, I dalis: 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimas, Toxicology in Vitro 12, 305–327.

19. EBPO Bandymų vadovo programa. ENV/MC/CHEM/TG(96)9: EBPO pasitarimo galutinė ataskaita pripažįstant ir įteisinant alternatyvius toksikologinio tyrimo metodus. OECD Publications Office, Paris,1996.

20. Lovell W. W. (1993), Fotoalerginių medžiagų in vitro atrinkimo schema. Toxicology in Vitro 7, 95–102.

21. Santamaria l., Prino G. (1972), Fotodinaminių medžiagų sąrašas. Organinės, biologinės ir medicinos chemijos pažanga. Vol. 3, Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdamas, XI–XXXV.

22. Spielman H., Lovell W. W., Hölzle E., Johnson B. E., Maurer T., Miranda M. A., Pape W. J. W., Sapora O., Sladowski D., (1994), Fototoksiškumo tyrimas in vitro. ECVAM 2 seminaro ataskaita ir rekomandacijos, ATLA, 314–348.

23. Spikes J. D. (1989), Fotojautrumas. Mokymas fotobiologijoje, K. C. Smith redakcija. Plenum Press, Niujorkas, 2 red., 79–110.

24. Borenfreund E., Puerner J. A. (1985), Toksiškumo nustatymas in vitro per morfologinę alteraciją ir neutralaus raudonojo dažo pagalba, Toxicology Letters 24, 119–124.

25. Lambert K. A., Warner W. G., Kornhauser A. (1996), Fototoksiškumo tyrimo gyvūnų modeliai. Dermatotoxicology, red. Marzulli F. N., Maibach H. I., Taylor & Francis, Vašingtono apygarda, 5 red., 515–530.

26. Tyrrell R. M., Pidoux M. (1987), Žmogaus odos ląstelių poveikio spektras: vidutinių ultravioletinių spindulių, artimų saulės šviesos ultravioletinių ir violetinių spindulių spektrui, veikiant epidermio keratocitus, santykinis įvertinimas. Cancer research 47, 1825–1829.

27. ZEBET/ECVAM/COLIPA. Balb/c 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimo standartinės darbo procedūros projektas, Liebsch M., 1997 m. gruodžio 23 d., patvirtinta 1998 m. kovo 6 d. EU/COLIPA projekto „In vitro fotodirglumas“ vadovybės.

28. Spielmann H., Balls M., Dupuis J., Pape, W. J. W., De Silva O., Holzhütteer H. G., Gerberick F., Liebsch M., Lovell W. W., Pfannenbecker (1998), UV fototoksiškumo studijų galimybės studija. ES direktyvos 76/768/EEB VII priedo 3T3 NRU in vitro fototoksiškumo bandymas, ATLA 26, 679–708.

29. Holzhütter H. G., Quedenau J. (1995), Ląstelių atsako į išorinį impulsą matematinis modeliavimas, Journal of Biological systems 3, 127–138.

30. Holzhütter H. G. (1997), Pagrindiniai matai gauti in vitro fototoksiškumo dviejų dozė-atsakas kreivių ir jų panaudojimas išankstiniam cheminių medžiagų fototoksiškumui in vivo nustatyti. ATLA 25, 445–462.

1 piešinys. 3T3 NRU metodo vaidmuo

cheminių medžiagų fototoksiškumo tyrimuose

Reguliavimo
priemonės, atsižvelgiant į Saugos tyrimai su
žmonėmis Fotogenotoksiškumo
in vitro bandymas
_____________________
Fotoalergijos
bandymas Medžiaga nėra ūmiai fotogeniška Tolesnio
fotobiologinio
tyrimo nereikia FOTOTOKSIŠKUMAS. 3T3 NRU FOTOKSIŠKUMO IN VITRO BANDYMAS Patvirtinimo bandymas
pagal šio metodo 11 punktą Ultravioletinės
sugerties spektras
tinkamuose tirpikliuose

______________